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下调Dlg1对猪卵母细胞体外发育的影响

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摘要

第一章 哺乳动物卵母细胞不对称性的主要分子基础

1.1 减数第一次分裂的对称性破坏和纺锤体迁移

1.1.1 Formine2等成蛋白家族介导Actin成核,起始纺锤体迁移

1.1.2 Arp2/3(Actin-related protein 2/3)复合物指挥的胞质流动驱动一个快速纺锤体移动相

1.1.3 对称性破坏和纺锤体迁移的双相模型

1.2 纺锤体定位以及皮质极化

1.2.1 减数分裂纺锤体发出皮质极性建立的信号

1.2.2 皮质Actin装配促进染色体和纺锤体定位

第二章 Dlg1(Discs large homologue 1)研究进展

2.2 Dlg1蛋白的功能

2.3 Dlg1与卵子发育

第三章 下调Dlg1对猪卵母细胞体外发育的影响

3.1 材料

3.1.1 仪器设备

3.1.2 主要试剂及培养液配制

3.1.3 实验材料及耗材

3.2 方法

3.2.1 猪卵巢获取、卵母细胞培养

3.2.2 卵丘颗粒细胞的去除

3.2.3 MⅡ期卵的激活及早期胚胎培养

3.2.4 显微注射用针的制备

3.2.5 多种猪组织细胞中Dlg1 mRNA的表达检测

3.2.6 猪卵母细胞与早期胚胎中Dlg1的表达和定位分析

3.2.7 siRNA干扰

3.2.8 数据统计及分析

3.2 结果

3.2.3 荧光显微镜观察Dlg1在猪早期胚胎中的表达定位

3.2.4 不同siRNAs对Dlg1表达的干扰效率检测

3.2.5下调Dlg1表达显著降低猪卵母细胞体外成熟率

3.2.6 下调Dlg1表达影响猪卵母细胞纺锤体的形成

3.2.7 孤雌激活后Dlg1的下调不影响猪胚胎卵裂以及囊胚形成

3.3 讨论

结论

本研究的创新点与进一步研究的课题

参考文献

致谢

作者简介

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摘要

哺乳动物肿瘤抑制基因Discs large homologue1(Dlg1),是膜相关鸟苷酸激酶((membrane-associated guanylate kinase,MAGUK)家族的一员,通过PDZ区与其他分子相互作用参与微管极化,心体再定向以及细胞迁移。Dlg1突变时,会出现微丝和微管的异常组装而导致的细胞极性异常,如:柱状上皮细胞去极化和细胞粘附分子的异常分布(吕鸿2010)。小鼠卵母细胞减数分裂过程中Dlg1表现为极性分布,并且这种极性分布与细胞骨架微丝微管之间存在着密切关系。本研究以猪卵母细胞为材料,旨在观察Dlg1在猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育进程中的表达定位,并在此基础上通过RNA干扰技术,引入外源性siRNA,进一步研究Dlg1在这两个发育过程中的作用。试验结果如下:
  1、通过QRT-PCR检测了猪多种组织细胞中Dlg1的mRNA表达水平。结果发现卵巢组织和肺组织中Dlg1的表达量最高,PEF中表达量最低。
  2、免疫荧光染色检测猪卵母细胞和早期胚胎中Dlg1的蛋白表达和分布。发现,在GV期猪卵母细胞中,Dlg1在整个胞质和细胞核均匀分布,从GVBD~PreMⅠ开始到MⅡ胞质中Dlg1逐渐向中心聚集,蛋白颗粒更明显,皮质处的分布明显减少;孤雌激活后的早期胚胎中,Dlg1在整个胞质弥散分布,但表达量逐渐下降2cell、4cell、囊胚期分别只有MⅡ期的46.9%、58.4%、29.66%。
  3、通过QRT-PCR和免疫荧光染色方法来筛选Dlg1的有效siRNA序列,结果显示siRNA-2干扰效率最高,可分别在mRNA和蛋白水平上下调Dlg1表达的82.1%和61.28%。
  4、通过显微注射的方法将Dlg1 siRNA-2注射到GV期的猪卵母细胞胞浆和孤雌激活后2h的胚胎中。结果显示:siRNA-2注射组的第一极体排出率为25.2%±3.3%,与对照组(73.4%±4.7%)相比显著下降,说明下调Dlg1能显抑制猪卵母细胞体外成熟。而且,免疫荧光染色发现下调Dlg1后影响体减数第一次分裂过程中微管装配及纺锤体的形成;siRNA-2注射组的卵裂率和囊胚率分别为73.3%±0.7%和19.8%±1.8%,与对照组相比(76.9%±2.1%;22.9%±1.35)差异不显著,说明下调Dlg1不影响猪早期胚胎的卵裂率和囊胚率。

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