GAPDH作为原核及真核生物通用型内标蛋白的研究及相关生物技术研发

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甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是生物体内一类十分保守的重要多功能酶类,广泛存在于原核及真核生物体内,如大肠杆菌、酵母、秀丽线虫、大鼠和小鼠等模式生物,主要参与生物体内糖代谢中糖酵解的第六步反应,即催化甘油醛-3-磷酸转化为1,3-二磷酸甘油酸并释放出能量(ATP)的过程。生物界中GAPDH单体分子量大小在30kD-40kD之间,天然状态的GAPDH主要以四聚体形式存在,其氨基酸编码序列在原核及真核生物体内均高度保守,同源性高达76％。原核及真核生物体内GAPDH蛋白是一类功能上十分保守的重要蛋白酶超家族,在不同的物种中分别由不同的基因编码,如微生物的gapA,gapB和gapC基因、酵母菌的TDH-1,TDH-2和TDH-3基因、秀丽线虫的gpd-1,gpd-2,gpd-3和gpd-4基因、大鼠的G3PDH基因等。不同物种中多种编码基因的存在一方面提示了不同GAPDH变体之间的功能代偿性,另一方面反映了个体应对环境压力的高度可调控性,为其作为管家蛋白的功能保守性提供了重要依据。
　　内标蛋白是生物体内一类重要的管家蛋白,具有序列保守性高、组织分布广等特点。目前常见的内标蛋白主要包括:细胞骨架蛋白肌动蛋白actin、微管蛋白Tubulin、细胞代谢相关蛋白GAPDH等。其中,GAPDH在同种细胞或组织中的蛋白表达量相对恒定,且很少受外部应激因素的影响,已被广泛用作RT-PCR和Westernblot等分子生物学实验标准化的内参分子,特别是其作为内标蛋白在组织或细胞内蛋白相对表达定量中的应用。虽然GAPDH作为内标蛋白的特性得到了广泛应用,但是以往仅集中于作为真核生物体内蛋白表达相对定量的研究,除了我们的研究揭示GAPDH可作为原核生物蛋白表达相对定量的内标蛋白外,到目前为止未见关于GAPDH作为原核生物蛋白表达相对定量内标蛋白的研究报道。
　　为了寻找适用于原核表达体系中外源蛋白表达相对定量的内标蛋白,我们采用不同鼠源单克隆抗体系统排查了目前常用于真核生物蛋白表达相对定量的内标蛋白,包括β-actin,α-tubulin和GAPDH等,以期找到一个既适合于真核生物蛋白表达相对定量又适合于原核生物蛋白表达相对定量的通用型内标蛋白。结果发现,采用鼠源GAPDH单克隆抗体可特异性地检测到微生物大肠杆菌BL21(DE3)细胞中的GAPDH蛋白,并且在诱导剂异丙基β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)存在的条件下内源性GAPDH蛋白的表达水平十分稳定,不随诱导表达时间的增加而改变。因此,我们推测GAPDH蛋白可能作为原核生物蛋白表达相对定量的内标蛋白,进而可用作原核及真核生物蛋白表达定量的通用型内标蛋白。
　　基于上述分析,我们首先利用鼠源GAPDH单克隆抗体分别检测了正常条件下大肠杆菌(包括BL21(DE3),HB101,DH5α和OP50四个株系)、酵母菌GS115、秀丽线虫、PC12细胞、小鼠脑组织和大鼠脑组织中GAPDH蛋白的表达情况,进而分别检测了大肠杆菌BL21(DE3)、酵母菌GS115、秀丽线虫和PC12细胞在不同应激条件下GAPDH蛋白的表达变化。结果发现,鼠源GAPDH单克隆抗体可广泛地识别不同物种GAPDH蛋白,且不同物种GAPDH的含量及分子量存在明显差异,原核生物中GAPDH分子量明显低于真核生物。同时,不同物种GAPDH可相对稳定地表达在不同的外界应激条件下,如大肠杆菌GAPDH的表达不随诱导剂IPTG浓度的增加而改变,也不随诱导表达时间的增加而变化;酵母菌GS115中GAPDH的表达不随诱导剂甲醇浓度的增加而改变,也不随诱导表达时间的增加而变化;秀丽线虫中GAPDH的表达不随百草枯(Paraquat,PQ)处理浓度的增加而变化;PC12细胞中GAPDH的表达不随亚硫酸钠(Sodium sulfite,SS)处理浓度的增加而改变。上述结果说明GAPDH可广泛且稳定地表达于原核及真核生物,可用于原核及真核生物蛋白表达相对定量的内标蛋白。
　　进一步地,为了明确鼠源GAPDH单克隆抗体能识别原核生物GAPDH变体类型,我们采用免疫共沉淀技术获得大肠杆菌HB101与鼠源GAPDH单克隆抗体相互作用的蛋白,进而利用MALDI-TOF-MS质谱鉴定及Mascot多肽指纹图谱分析比对。结果显示,大肠杆菌体内被鼠源GAPDH单克隆抗体识别的GAPDH变体为GapA蛋白,质谱鉴定显示序列覆盖率达52%。同时,为了明确鼠源GAPDH单克隆抗体对不同物种GAPDH变体的识别特性,我们分别针对大肠杆菌BL21(DE3)的gapA和gapC基因、酵母菌GS115的gap-3基因、秀丽线虫的gpd-1,2,3,4基因和PC12细胞的g3pdh基因进行亚克隆及原核诱导表达,针对外源表达的GAPDH和内源表达的GAPDH分别采用鼠源6×His单克隆抗体和鼠源GAPDH单克隆抗体进行检测。结果显示,上述不同GAPDH变体基因在原核表达系统均实现了高效表达,且鼠源GAPDH单克隆抗体可识别大肠杆菌的GapA蛋白、酵母菌GS115的Gap-3蛋白、秀丽线虫的Gpd-1,2,3,4蛋白和PC12细胞的G3PDH蛋白,但不能识别大肠杆菌的GapC蛋白。
　　为了检测上述在大肠杆菌中过表达的不同物种GAPDH变体蛋白是否具有生物学活性,我们针对大肠杆菌表达体系的细胞裂解液进行了动态酶活扫描。结果显示,与空载体对照组菌体裂解液相比,除了过表达大肠杆菌GapC蛋白的菌体裂解液没有酶活特性外,其它外源过表达不同GAPDH变体的菌体裂解液均具有明显的酶活,说明原核生物体内GapA蛋白可能主要参与糖酵解代谢的调控。最后,为了阐明为何鼠源GAPDH单克隆抗体不能识别大肠杆菌GapC蛋白,我们针对上述不同物种GAPDH变体的氨基酸序列采用ClustalW/X软件进行同源序列比对,并且采用phylip-3.69软件进行分子进化分析。结果显示,不同物种GAPDH氨基酸编码序列同源性高达76%,并且不同物种GAPDH变体在进化上高度保守,但大肠杆菌gapC基因在进化上与其他GAPDH变体相距较远,说明由于大肠杆菌gapC基因在进化上与其它GAPDH变体相距较远,故而其催化底物NAD+生成NADPH的活性较低。综上所述,该部分工作证明GapA蛋白可用于原核生物蛋白表达相对定量的内标蛋白,为原核及真核生物体内蛋白相对表达定量提供了重要技术参考。
　　除此之外,本研究也开展了以下两方面相关生物技术研发的工作:
　　1.利用冷冻干燥技术建立了一种组织样本长期稳定性储存及室温下长途运输的新方法:冷冻干燥技术作为一种常规分子生物学技术已被广泛用于食品工业、医药、生物技术和组织工程等多个领域生物样本的保存,如植物种子、细菌、酵母、牛心包细胞、脂质体、小鼠精子和大鼠肾脏等,但到目前为止未见冷冻干燥对生物组织样本RNA和蛋白质生物活性影响的报道。为此,我们首先针对正常C57小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃和脑等组织进行取材,按对照组、热烘干组和冷冻干燥组进行分组处理,处理后的样本采集图像并提取总蛋白,利用SDS-PAGE和明胶酶谱检测不同组织样本蛋白质的稳定性和生物酶活;针对冷冻干燥组小鼠脑组织样本,室温放置1天、3天、7天和14天后进行复水并提取组织总RNA和总蛋白,利用RT-PCR技术分别扩增GAPDH、VEGF和Cox-2基因以鉴定RNA的稳定性,并且采用SDS-PAGE和Westernblot技术分别检测脑组织中蛋白质的稳定性及免疫活性。结果显示,冷冻干燥技术不仅可相对保持组织样本形态结构的完整性,而且可保持组织样本RNA和蛋白质的稳定性,不随室温放置时间的增加而降解,并且冷冻干燥后的组织样本的生物酶活和免疫活性基本不受影响。因此,该工作建立了一种组织样本长期稳定性保存及室温下长途运输的新方法,为国际间生物组织样品的长途稳定性运输及学术交流提供了一个重要方法。
　　2.我们围绕如何提高原核生物外源蛋白表达效率问题开展工作,以不同物种超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,Sod)为实验对象,研究了Tat核心肽段促进外源蛋白高产量、可溶性表达的普适性及其潜在作用机理:Tat核心肽段是HIV-1病毒编码的一段富含碱性氨基酸序列的穿膜肽(pI=12.8),能介导多种外源物质通过各种膜性结构并保持生物活性。我们前期研究该穿膜肽跨膜转导功能时,意外发现其还具有促进外源蛋白高产量、可溶性表达的新功能并在国际上最先报道了该现象,但作用机理尚不清楚。为此,我们以大肠杆菌、酵母、秀丽线虫和小鼠Sod为研究对象,通过RT-PCR方法获得了不同物种Sod编码基因并构建了系列含有和不含有Tat标签的原核表达载体,常规诱导表达后采用SDS-PAGE、透射电镜、Westernblot技术检测了系列融合蛋白的表达定位及蛋白表达水平;进而采用亲和层析技术分离纯化获得了Tat-SodA,B,C和SodA,B,C蛋白,利用圆二色谱技术测定了Tat融合和非Tat融合蛋白的二级结构;同时,采用实时定量PCR技术检测体外过表达Tat-SodA,B,C和SodA,B,C蛋白的大肠杆菌SodA,B,C基因的mRNA转录水平,进而测定体外过表达Tat-SodA,B,C和SodA,B,C蛋白的菌体裂解液酶活;最后,针对体外过表达Tat-SodA,B,C和SodA,B,C蛋白的菌体测定其抗PQ活性。结果显示,Tat核心肽段可明显增加外源蛋白Sod的表达量,且各蛋白均高效表达于细胞质;Tat融合蛋白的二级结构中α-螺旋增加,β-折叠减少;Tat融合蛋白组靶基因mRNA的转录水平明显高于非Tat融合蛋白组;Tat融合蛋白过表达菌体裂解液具有明显的生物酶活;Tat融合蛋白过表达的菌体具有明显的抗PQ活性,特别是Tat-SodA和SodA组。因此,该工作说明Tat核心肽段可通过增加外源基因mRNA的转录水平而促进其高产量、可溶性表达,且具有普适性,不仅为外源蛋白的高产量、可溶性表达提供了重要方法,而且为具有潜在生物活性药物的开发研究提供了重要参考。
　　总之,本研究以“GAPDH可作为原核及真核生物的通用型内标蛋白”的研究为主线,结合“冷冻干燥技术在组织样本长期、稳定性保存中的应用”和“Tat核心肽段促进外源蛋白高产量、可溶性表达的普适性及其潜在作用机理”的研究,建立了一系列生物技术的新技术和新方法,为不同生物技术领域新技术和新方法的开发应用提供了十分重要的参考。

著录项

作者
吴永红;
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作者单位

解放军军事医学科学院;

中国人民解放军军事医学科学院;

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授予单位解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名张成岗;
年度 2013
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正文语种中文
中图分类生物工程学（生物技术）;
关键词
甘油醛-3-磷酸脱氢酶; 生物技术; 内标蛋白; 指纹图谱; 免疫活性; 基因编码;

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