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慢性睡眠剥夺对大鼠前额皮质多巴胺D1受体信号通路的影响

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第一部分 慢性睡眠剥夺对前额皮质全基因表达谱的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 慢性睡眠剥夺对前额皮质内D1R信号通路的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

文献综述

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摘要

睡眠剥夺(SD)是一种普遍存在的社会现象，长时间SD将会严重影响机体的行为、学习和工作。与短期的急性睡眠剥夺(ASD)相比，长期的慢性睡眠剥夺(CSD)对高级神经功能（学习记忆、认知和决策等）和工作效率的影响更加严重。前人研究表明PFC在CSD导致的神经行为学改变中发挥着重要作用，在我们的前期研究中发现CSD可导致大鼠学习记忆能力和自主活动能力的降低，同时PFC内多巴胺(DA)含量下降，多巴胺D1受体(D1R) mRNA和蛋白表达水平降低，PFC深层神经元超微结构受损，而D1R激动剂SKF38393干预后，可改善这一现象。这些实验表明PFC内DA及其D1R可能参与调节了CSD导致的学习记忆能力以及探索能力下降的过程。
　　 D1R作为一种G蛋白偶联受体，可通过AC-cAMP-PKA通路、磷酸肌醇通路和有丝分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路调控核内转录因子cAMP反应原件结合蛋白(CREB)的表达，进而调节神经细胞的功能。而在CSD导致PFC功能障碍以及激动D1R改善PFC的过程中，D1R主要通过哪条信号通路调节神经功能？其中关键信号分子是什么？是否还存在其他调节途径？均有待于进一步研究探讨。因此，我们通过基因表达谱芯片检测了大鼠PFC内全部基因的转录表达水平，分析寻找CSD导致PFC结构和功能改变的新的信号通路及其关键信号分子。通过RT-PCR和Western blot技术分别验证了D1R信号通路中关键信号分子的基因转录水平和蛋白表达水平。阐明D1R调控CSD导致PFC结构和功能受损过程的主要通路和信号分子。
　　 第一部分慢性睡眠剥夺对前额皮质基因表达谱的影响
　　 目的:观察CSD对PFC内各个基因转录表达水平的影响，探寻调节CSD导致PFC结构和功能改变的关键信号分子及其相关的功能途径。
　　 材料与方法:选用成年健康雄性Sprague Dawle大鼠60只，经体重、Morris水迷宫训练和小平台站立训练筛选出45只，并随机分为三组:大平台环境处理对照(TC)组，慢性睡眠剥夺(CSD)组和激动剂干预(SKF)组，每组样本量为15。TC组大鼠放入水环境相同的大平台对照箱内保证其正常睡眠，其他两组采用改良多平台水环境剥夺法(MMPM)对大鼠进行每天18h(16:00-10:00)快速眼动睡眠（REM）剥夺，持续21d。从剥夺第15d开始，每天上午(10:00-11:00)，TC组与CSD组每只大鼠腹腔注射1mL PBS对照溶液，SKF组每只大鼠腹腔注射1mL多巴胺D1R特异激动剂SKF38393（1mg/kg），连续给药7d。睡眠剥夺结束后，快速取脑，冰上分离双侧PFC，置于-80℃冻存备用。每组随机选取4个样本（其中3个用于检测，1个备用），通过表达谱基因芯片检测PFC内各个基因的转录表达水平。然后挑选19个基因，取用于芯片检测的3个样本的剩余RNA，通过实时定量PCR技术(RT-PCR/qPCR)验证芯片检测质量。
　　 结果:芯片验证拟合度为r2=0.85，芯片检测合格。筛选差异基因(p＜0.05且FC≥1.5)，各组表达情况为:
　　 与TC组相比，CSD组存在208个差异表达基因，其中88个基因表达下调，120基因表达上调;对两组差异基因进行GO基因功能分类，富集度检验p＜0.05的功能分类情况为:三级功能分类有29个，二级功能分类有5个;两组差异基因所关联的信号通路中，富集度检验p＜0.05的信号通路有22个，其中主要包括MAPK、各种代谢调节、昼夜节律调节、免疫调节等通路。
　　 与CSD组相比，SKF组存在115个差异基因，其中57个表达下调，58个表达上调。与TC组相比，SKF组存在126个差异基因，其中59个表达水平下降，67个表达水平升高。
　　 此外，与CSD组相比，TC组与SKF组具有Hspb1，S100a9，Homer1等14个相同表达趋势的差异基因。与TC组相比，CSD组与SKF组具有Per2、Chm、Cm13等15个相同表达趋势的差异基因。
　　 讨论:CSD组与TC组的差异基因最多，达到208个，CSD损伤PFC结构导致高级神经功能障碍的过程，可能是通过影响这些基因的表达来实现的。这些差异基因可能与发育、细胞杀伤、免疫系统和各种代谢调节等功能或途径的调控有关。值得注意的是，D1R激动剂SKF38393的干预，使Hspb1，S100a9，Homer1等14个受CSD影响的基因恢复到了正常水平，这说明在激动D1R改善CSD对PFC结构和功能损伤的过程中，可能是通过这些基因发挥了主要的调节作用。这些基因多与钙离子通路、MAPK通路、应激以及凋亡等功能途径有关，因而，除了D1R介导的信号通路外，SKF38393可能通过这些基因及其相关途径来影响CSD对PFC结构和功能改变。
　　 此外，激动D1R并未完全的反转CSD对PFC内基因表达的影响作用，比如Per2、Chm、Cm13等15个基因的表达并没有受到SKF38393的影响，所以还可能存在多巴胺受体系统以外的其他损伤机制。
　　 第二部分慢性睡眠剥夺对前额皮质内D1R信号通路的影响
　　 目的:研究CSD对PFC内D1R所介导的信号通路的影响，阐明D1R调控CSD导致PFC结构功能受损过程的主要途径和信号分子。
　　 材料与方法:分析芯片结果中多巴胺D1R所介导通路内的已知信号因子基因的表达水平变化;取每组6个样本，通过RT-PCR技术验证与D1R信号通路相关的17个信号分子的基因表达水平。取每组4个样本，通过Western blot技术检测与D1R信号通路相关的7个调节分子的蛋白表达水平和磷酸化水平。
　　 结果:芯片结果指出:CSD导致多巴胺D1R所介导通路内的已知信号分子中有15个基因发生改变（p＜0.05或FC≥1.5），其中Camk4和Camk1g差异明显(p＜0.05且FC≥1.5)，与CSD组相比，SKF组中Rap1a、Rasgrf1和Creb三个基因恢复到正常水平(FC≥1.5)。
　　 RT-PCR结果显示:与TC组相比，CSD组内Plcb1，Camk4，Camk1g，Rap1a，Rap1b和Erk1的表达显著下降，而与CSD组相比，SKF组内Plcb1，Camk4，Drd1a，Prkaca，Darpp32，Pkcγ，Rap1a和Rap1b的表达显著增高。
　　 Western blot结果显示:在总蛋白水平上， CSD组内PLCβ和NMDAR1表达显著性降低，而在SKF组中PLCβ，CaMKⅣ和CREB的表达显著升高;在磷酸化水平上，CSD组PLCγ，IP3R1，CaMKⅣ，NMDAR1和CREB的表达显著性降低，而SKF组的7个被检测分子的表达均显著性升高。
　　 讨论:本教研室前期研究表明CSD导致的学习记忆能力下降与DA及其D1R调节受阻致使PFC神经元结构和功能损害有关。而D1R可通过AC-cAMP-PKA，MAPK和磷酸肌醇三条信号通路调节核内CREB等转录因子的表达。
　　 由芯片和PCR对基因的检测发现，在基因的转录水平上，CSD没有显著改变PKA通路中关键分子的基因表达，而芯片差异基因的富集检验推测出CSD对大鼠PFC内MAPK通路的调节产生重要影响，经检验推测MAPK通路中由小G蛋白Rap和Ras调节的ERK1/2通路可能在CSD导致PFC改变和之后恢复的过程中发挥重要调节作用。研究还发现CSD显著改变了磷酸肌醇通路中磷脂酶C(PLC)，肌醇三磷酸受体(IP3R)和钙/钙调素依赖的蛋白激酶(CaMKs)等分子的基因转录和蛋白磷酸化水平，这些分子的基因与胞内钙离子水平的调节有关，而D1R激动剂SKF38393的干预可反转这一现象。综上所述，可推测在CSD损害PFC组织结构和功能的过程中，PFC内由D1R介导的MAPK通路和磷酸肌醇通路可能起主要调节作用，而非PKA通路。
　　 值得注意的是，除了与激活IP3R相关的胞内钙库释放外，谷氨酸NMDAR途径和膜钙离子通道都参与胞内钙离子水平的调节。本研究发现D1R被激动后，NMDAR1磷酸化水平增强，因此，我们推测在CSD过程中，PFC内磷酸肌醇通路可能与NMDAR途径一起共同调节了与胞内钙离子水平相关的生物学功能，而CaMKⅣ可能在这一过程中起关键的调控作用。

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