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【6h】

急性移植物抗宿主病宿主中供者来源造血干祖细胞的功能研究

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摘要

研究目的:
　　 造血干细胞(HSC)是所有成熟血细胞的来源。异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前血液系统恶性疾病最主要的治疗手段之一。但移植过程中及移植后的并发症是影响患者生活质量甚至导致患者死亡的重要因素，其中急性移植物抗宿主病(acutegraft-versus-hostdisease，aGVHD)是异基因造血干细胞移植后主要的并发症之一。重度aGVHD病人多出现一系、两系甚至全血细胞减少，对刺激因子反应欠佳，治疗上依赖成分输血，带来一系列经济及疗效方面的问题。有研究证实aGVHD是造血功能低下的主要危险因素，而aGVHD患者出现血小板减少是预后差的因素之一。但是，就骨髓移植的受者而言，造血系统来源于供者，因此被认为并不是aGVHD的主要攻击靶点。
　　 本课题以半相合小鼠aGVHD为模型，研究aGVHD宿主体内供者来源正常造血干/祖细胞(HSC/HPC)数量和分化过程障碍；进一步分离aGVHD环境中的正常造血细胞，通过竞争性骨髓移植(cBMT)评估aGVHD环境对供者来源的正常HSC造血重建能力的影响。课题还在HSC/HPC水平阐明aGVHD环境中正常造血组织细胞(尤其是红系、巨核系)减少的分子机制，为临床治疗提供线索。
　　 材料和方法:
　　 小鼠骨髓移植受体小鼠：雌性CB6F1小鼠[白细胞抗原表型(以下简称表型)：CD45.21，为雌性C57BL/6J与雄性BALB/C的F1代。供体小鼠：骨髓细胞供体B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyJ(B6.SJL，表型CD45.1)。半相合小鼠aGVHD骨髓移植模型CB6F1受体小鼠移植前均接受8Gy一次照射，随机分为两组。aGVHD组每只受体小鼠移植B6。SJL小鼠的骨髓有核细胞(bonemarrownucleatedcells，BMNC)5×106(CD45.1+)和C57BL/6J小鼠的脾细胞6×107。对照组小鼠仅移植相同数量B6.SJL小鼠的BMNC(CD45.1+)。移植后检测流式细胞术检测外周血、骨髓中供者来源造血细胞(CD45.1+)的频率。HSC/HPC的数量和频率以Flk2-CD34-Lin-c-Kit+Sca-1+(Flk2-CD34-LKS)为具有长期造血重建能力的HSC(LT-HSC)的表型，Flk2-CD34+LKS和Flk2+CD34+LKS分别为短期造血重建造血干细胞(ST-HSC)和多能造血祖细胞(MPP)的表型：Lin-c-Kit+Sca-1+(LKS)包括LT-HSC、ST-HSC和MPP，代表广义的小鼠HSC表型。以CD34+CD16/32loLin-c-Kit+Sca-1-(CD34+CD16/32loLKS-)为髓系定向祖细胞(CMP)的表型，CD34+CD16/32hiLKS-和CD34-CD16/32loLKS-分别为粒单系定向祖细胞(GMP)和巨红系定向祖细胞(MEP)的表型。Lin-c-Kit+Sca-1-(LKS-)包括CMP、GMP和MEP，代表广义的小鼠HPC表型。移植后不同时间点流式细胞术分别检测aGVHD组与对照组小鼠体内HSC和HPC的数量和频率。集落形成单位(CFU)检测移植后2周分选aGVHD组和对照组供者来源造血细胞(CD45.1+)进行CFU检测，10天后显微镜下计数集落数，每组4个复孔。细胞周期分析移植后1周、2周、3周，用RNA染料Ki67和DNA染料Hoechst33342盒结合HSC/HPC细胞表面标记(Lin-Scal+CD150+)，流式细胞术检测两组HSC/HPC的细胞周期水平(G0期/G1期/(G2+S/M)期)。细胞凋亡分析移植后1周、2周、3周，用AnnexinV-PE试剂盒结合HSC/HPC细胞标记(Lin-Scal+CD150+)，流式细胞术检测两组HSC/HPC的凋亡水平。基因表达检测移植后2周，流式细胞术分别分选aGVHD组和对照组的LKS、Flk2-CD34-LKS(LT-HSC)并DCD34+CD16/32loLKS-(CMP)细胞群，并以RLT+β-巯基乙醇重悬。采用RNeasyMiniKit试剂盒提取RNA，两步法从细胞直接制备cDNA。以GAPDH为参照基因，用Real-timeRT-PCR方法检测GATA-1、GATA-2、c-mpl和FOXO3a等红系、巨核系生成相关调节基因的相对表达量。根据aGVHD组和对照组不同基因的Ct值，计算不同造血微环境中，不同基因在各细胞群的相对表达量。环孢素(CsA)干预移植后第0天起腹腔注射的形式给予CsA10mg/Kg/d，直至观察期(30天)结束。同时监测生存、体重、造血各系比例及分化情况。统计学分析计量资料比较采用Studentttest，计数资料比较采用x2test。生存资料采用Prism5.0软件分析。
　　 结果:
　　 1.成功建立半相合小鼠aGVHD模型，aGVHD发病率为100％。aGVHD组小鼠移植10天后逐渐出现弓背、脱毛、腹泻、体重减轻等典型的aGVHD症状，中位生存时间是19.5天(15-23天)。对照组在30天观察期内全部存活。aGVHD发病率为100％。aGVHD组小鼠与对照组相比呈现外周血三系急剧减少。移植后+2w，aGVHD组小鼠全髓细胞数为对照组的43％[(1.51±0.10)×108vs(0.66±0.10)×108，P<0.05]，aGVHD组供者来源造血细胞(CD45.1)的植入率显著低于对照组[(57.78±2.05)％vs(98.23±0。82)％，P<0.05]。
　　 2.aGVHD环境中HSC/HPC数量显著低于对照组而频率显著高于对照组移植后2周，aGVHD组骨髓HSC/HPC数量低于对照组，在HPC表型细胞群中尤为明显。但在供者来源细胞中的频率显著高于对照组，在HSC表型细胞群中尤为明显。
　　 3.aGVHD宿主中成熟细胞中B细胞频率显著低于对照组移植后每三天检测外周血各系的细胞比例发现，aGVHD组小鼠外周血各系细胞减少，尤其在B细胞系中更为明显。移植+12天后，aGVHD组小鼠B细胞在外周血供者来源细胞中的频率显著低于对照组；而成熟T细胞及成熟B细胞在外周血供者来源细胞中的频率，与对照组相比无显著差别；成熟单核细胞在外周血供者来源细胞中的频率则高于对照组。
　　 4.aGVHD环境中供者来源造血细胞CFU形成能力显著高于对照组移植后第2周，aGVHD组供者来源造血细胞集落形成能力均不同程度地高于对照组。CFU-E[(4。25±0.63)vs(1.0±0.42)，P=0.005]、BFU-E[(0.75±0.48)vs(0.5±0.29)，P=0.67]、CFU-G[(8.25±0.48)vs(1.25±0.25)，P=0.000]、CFU-M[(4.25±0.86)vs(1.5±0.29)，p=0.022]、CFU-GM[(3.25±0.85)vs(1.25±0.25)，P=0.066]、CFU-Mix[(7.50±1.85)vs(2.25±0.75)，P=0.039]，aGVHD组CFU总数约为对照组的4倍[(28.25±2.28)vs(7.75±0。75)，P=0.000]。
　　 5.aGVHD宿主中供者来源造血细胞归巢未受影响移植后16小时，检测aGVHD组与对照组骨髓中供者来源细胞比例(CD45.1+％)来表示归巢效率，两组小鼠无显著差异。
　　 6.aGVHD宿主中HSC/HPC更为静息移植后+7d，aGVHD组小鼠HSC细胞周期中G0期比例高于对照组，分别为(42.86±1.77)％和(35.32±1.23)％(P=0.01)；而(G2+S/M)期比例低于对照组，分别为(32.81±1.13)％和(43.94±2.36)％(P=0.001)。
　　 7.aGVHD环境对供者来源造血细胞的寿命无显著影响移植后+2w，aGVHD环境中全BM、HPC、MPP、HSC凋亡情况检测均显示与对照组无统计学差异。结果说明，aGVHD的发生并不直接增加HSC/HPC凋亡比例，在aGVHD环境中造血干祖细胞的减少，并不由于其生存时间缩短引起。
　　 8.aGVHD宿主中造血祖细胞阶段存在分化阻滞移植后2周，aGVHD组骨髓CMP/GMP/MEP数量显著低于对照组，其中CMP/MEP占CD45.1+细胞频率显著低于对照组，而GMP占CD45.1+细胞频率显著高于对照组。与此同时比较LT-HSC/ST-HSC/MPP占LKS比例，两组间无统计学差异；而CMP/GMP/MEP占LKS-细胞比例上，两组的差异具有统计学意义。提示在CMP到MEP阶段存在分化阻滞。
　　 9.转录水平基因表达证明，aGVHD环境中红系、巨核系分化障碍主要由于CMP向MEP分化障碍所致aGVHD环境中CMP细胞群红系、巨核系相应正性调控基因GATA-1、GATA-2、c-mpl、FOG、RUNX1等表达显著低于对照组，而负性调控基因FOXO3a表达显著高于对照组。而在LT-HSC/LKS阶段无相应改变。以上数据说明，在aGVHD环境中，红系、巨核系的分化障碍主要是由于CMP向MEP分化受阻所致。
　　 10.CsA能改善aGVHD宿主中造血分化异常在构建aGVHD模型的同时，从第0天开始CsA干预组腹腔注射的形式给予每天10mg/KgCsA，发现在生存情况和体重减轻方面优于aGVHD组，全髓细胞数及BMCD45.1+％方面得到一定程度的提高，并且在CMP/GMP/MEP的分化阶段CsA能有效控制aGVHD环境所致的分化障碍。
　　 结论:
　　 1.首次证明在aGVHD环境中，供者来源HSC/HPC数量显著低于对照组，但HSC/HPC占供者来源CD45.1+细胞比例显著高于对照组，且体外CFU克隆形成能力显著增强。aGVHD组HSC相对静息，HSC/HPC凋亡分析上两组无显著差别。结果说明，aGVHD的发生主要抑制HSC增殖和向下分化，HPC细胞池正常向下分化且得不到上游细胞分化补充因而耗竭，这一效应并非由于生存时间缩短所致。
　　 2.首次证明aGVHD宿主出现的红系、巨核系急剧减少主要由于CMP向MEP分化障碍所致。CMP、MEP在供者来源细胞中比例显著低于对照组，而GMP比例显著高于对照组；且在LKS-分化阶段，CMP/GMP/MEP占LKS-细胞比例两组之间差异均具有统计学意义。CMP转录水平的检测结果表明，与对照组相比，GATA-1、GATA-2、c-mpl、FOG、RUNX1等红系、巨核系正性调控因子表达下降，而负性调控因子FOXO3a表达上升。
　　 3.CsA作用下，aGVHD小鼠生存和体重情况明显好转，供者来源细胞植入比例增加，且CMP向MEP分化障碍得以改善。

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