抗银屑病药动物模型的建立及肿瘤坏死因子/受体超家族在银屑病发病中的作用探讨

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银屑病是一种发病率较高的红斑鳞屑性皮肤病，其治疗复杂而棘手。其发病机理尚未完全明确，目前主要认为是遗传背景下的一种由T细胞介导的自身免疫性疾病。半个多世纪以来，有不同的动物模型被用于研究银屑病，但都因为仅仅只反映某一方面的机制而无法通用。在Th1/Th2疾病理论体系下，银屑病中Th1型细胞及其细胞因子占优势，属于Th1型疾病，寻找一种能体现银屑病这一免疫学特点的动物模型将对银屑病的研究具有重大意义。
　　通过运用猪甲状腺球蛋白、弗氏佐剂及高碘饮水，我科实验人员在先前的研究中已经成功地在Wistar大鼠身上建立了实验性自身免疫性甲状腺炎(experimentalautoimmune thyroiditis，EAT)模型，本研究继续采用该方法建立EAT模型，并作了适当改进。以血清抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibody，TGAb)水平及甲状腺组织病理改变评价不同抗银屑病药物的疗效；分离外周血单一核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，利用基因芯片技术高通量、高准确性、高灵敏度的优势，从整体细胞因子免疫网络水平对不同抗银屑病药物调节Th1/Th2平衡的机理进行研究，并对若干指标以realtime PCR进行验证。
　　针对基因芯片发现的若干肿瘤坏死因子/受体超家族成员的变化，在银屑病患者身上验证。Realtime PCR检测其在外周血及皮损中mRNA表达量，免疫组化检测皮损中相应蛋白的表达水平，从而探讨肿瘤坏死因子/受体超家族在银屑病发病机理中的可能作用。
　　第一部分用实验性自身免疫性甲状腺炎模型评价抗银屑病药物疗效的可行性探讨
　　目的:验证EAT模型的建立方法，研究不同抗银屑病药物治疗该模型的疗效，探讨其作为抗银屑病药物疗效评价活体模型的可行性。
　　方法:运用猪甲状腺球蛋白、弗氏佐剂以及高碘(0.05％)饮水在健康Wistar大鼠上建立EAT模型。随后EAT模型大鼠随机分成模型组、环孢素组、依曲替酸组及沙利度胺组，给予相应药物混悬液灌胃治疗30天(模型组给予生理盐水，环孢素组每天每只给予环孢素A20.625mg/kg，依曲替酸组给予依曲替酸2.75mg/kg，沙利度胺组给予沙利度胺6.875mg/kg)。同时以正常大鼠(不予灌胃治疗)作为正常对照组。建模完成及药物治疗结束后两次检测血清中TGAb抗体水平并观察甲状腺组织病理改变。
　　 Realtime PCR法检测大鼠PBMCs中TNF-α、IL-10mRNA的表达情况。
　　结果:建模后模型组大鼠血清中的TGAb抗体水平明显高于正常组(P＜0.01)，其甲状腺组织亦发生明显的炎症反应。模型组PBMCs中TNF-α mRNA表达水平升高，而IL-10mRNA的表达水平下降(P＜0.01)。经环孢素A、依曲替酸、沙利度胺处理后EAT大鼠TGAb水平明显降低(P＜0.01)，各治疗组间也有显著差异(P＜0.05)。在甲状腺炎症严重程度方面，各治疗组与正常对照组及模型组相比较有显著性差异(P＜0.05)，而各治疗组间无显著差异(P＞0.05)。
　　结论:采用甲状腺球蛋白、弗氏佐剂及高碘饮水免疫动物，可成功建立EAT模型。EAT大鼠外周血中存在一定程度的Th1偏态性。环孢素A、依曲替酸及沙利度胺对EAT大鼠血清TGAb水平均有下调作用，以环孢素A最为明显。EAT与银屑病都属于Th1型疾病，他们的若干免疫与细胞因子网络具有相似性，若干药物疗效及机理也具有一定相似性。因此，可以把EAT模型作为抗银屑病药物疗效评价的活体模型，并以环孢素A作为药物治疗效果的阳性对照，以TGAb水平作为判断药物是否起效的检测指标。
　　第二部分抗银屑病药物对实验性自身免疫性甲状腺炎模型Th1/Th2平衡的调节机制研究
　　目的:分析不同抗银屑病药物作用前后EAT大鼠PBMCs中Th1-Th2基因表达谱的差异性，寻找不同药物调节Th1/Th2平衡的相关基因并分析其可能机制。
　　方法:将上述各组大鼠PBMCs分离后按组混合，提取总RNA，逆转录成cRNA，与OligoGEArray(R) Th1-Th2-Th3基因芯片进行杂交，Scan Array Scanner扫描仪进行扫描，GEArray软件分析，筛选出不同药物治疗前后表达有差异的基因并作分类分析。部分芯片结果用realtime PCR进行验证。
　　结果:筛选出三个治疗组共同表达基因，有4个基因(Ccr4、Ccr9、Gata3、Glmn)三组共同上调；有15个基因(CD4、Cxcr3、Cmkbr3、Fosl2、Ifng、IL-18、Nfatc4、Socsl、Stat1、Tbx2l、Tnf、Tnfrsf4、Tnfsf4、Tnfsf5、Tnfsf6)共同下调。以realtime PCR验正TNF-α、IL-10、T-bet、Gata3 mRNA表达，与基因芯片结果吻合。
　　结论:各抗银屑病药物均能通过上调Th2相关基因、下调Th1相关基因的表达以调节Th1/Th2平衡。其中趋化因子及其受体，信号转导途径以及肿瘤坏死因子及其受体超家族等在基因芯片结果中有显著变化，可能在银屑病的免疫反应中起着重要的作用。这些研究为深入研究银屑病发生、发展、缓解机制，以及针对这些靶位进行药物研制开发提供了理论依据。
　　第三部分肿瘤坏死因子/受体超家族在银屑病发病中的作用探讨
　　目的:观察银屑病患者外周血及皮损中肿瘤坏死因子/受体超家族成员TNF-α、OX40、OX40L及HVEM的表达，探讨其在银屑病发病中的作用。
　　方法:以正常人外周血及皮肤为对照，realtime PCR检测90例寻常型银屑病患者外周血及20例患者皮损中TNF-α、OX40、OX40L及HVEM mRNA表达，免疫组化检测皮损中OX40、OX40L蛋白表达水平。
　　结果:银屑病患者皮损及外周血TNF-α mRNA水平增高(P＜0.05)，OX40 mRNA水平在皮损中增高(P＜0.05)，在外周血中无明显差异(P＞0.05)，而OX40L mRNA水平在外周血及皮损中均降低(P＜0.05)，外周血及皮损中HVEM mRNA表达与正常对照相比无显著差异(P＞0.05)，皮损中OX40、OX40L蛋白表达均高于正常皮肤(P＜0.05)。
　　结论:肿瘤坏死因子/受体超家族成员TNF-α、OX40、OX40L等在银屑病的Th1-Th2细胞亚群及细胞因子的调整、CD4+T细胞的定向迁移等过程中发挥重要的作用，可望以此为靶位进行免疫治疗。实验中银屑病患者外周血及皮损中OX40L mRNA水平降低，而HVEM mRNA水平与正常对照相比均无显著差异，可能与我们的病例选择大多处于稳定期有关。

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作者
徐晓光;
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作者单位

第二军医大学;

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授予单位第二军医大学;
学科皮肤病与性病学
授予学位博士
导师姓名顾军;
年度 2010
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类牛皮癣（银屑病）;皮肤性病科药物;
关键词
银屑病; 肿瘤坏死因子; 受体超家族成员; Th1基因; Th2基因; 抗银屑病药物;

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