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脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折愈合的实验研究及神经生长因子对失神经骨折愈合的影响

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前言

第一部分脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折模型的制备及骨痂形态对比性研究

第二部分脊髓完全性损伤对大鼠胫骨骨折愈合质量的影响

第三部分脊髓完全性损伤对大鼠胫骨骨折断端骨痂骨化影响的实验研究

第四部分脊髓完全性损伤大鼠胫骨骨折骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原的蛋白表达

神经系统对骨再生的调节

在读期间主要学术活动

致谢

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摘要

背景：在临床实践中观察到一个现象，截瘫和颅脑损伤患者伴随的四肢骨折往往可以见到大量骨痂过度生长，甚至在肌肉中可以出现异位骨化，但是这种骨痂强度差，编织骨向板层骨转化慢，因此认为神经系统参与了骨折愈合过程，推测神经系统最终与骨生成和骨转化有关。采用脱钙的免疫组织化学方法对骨组织进行研究中发现，骨不连的断端骨痂、异位成骨及失神经状态下的骨痂在组织结构上有一个共同点，就是少有或者没有神经支配，那么能否通过研究神经对骨再生支配与调控机理，最终找到解决骨不连及异位骨化的治疗方法。 神经生长因子(NGF)是于1952年发现的第一个神经营养因子，在神经系统中调节中枢和外周神经元生长、发育、分化以及维持正常存活的作用已得到公认。NGF广泛分布于全身器官，除营养神经外，还参与一些其他的生理活动，如刺激单核细胞、肥大细胞的增殖和分化，促进皮肤溃疡、角膜溃疡和皮肤切口的愈合，刺激毛细血管生长以增加局部血供等。近来，研究发现在正常骨组织和骨折骨痂中有NGF及其受体的表达，同时局部给予外源性NGF对骨折愈合具有促进作用。这说明NGF可能也是骨折愈合复杂因子网络中的一员。在失神经状态下能否应用神经生长因子改善骨折过程中骨痂钙化骨力差从而为神经生长因子促骨折愈合找到理论依据还是一个新的课题。 目的：1、对T10脊髓完全性横断损伤状态下大鼠胫骨骨折模型的后肢感觉运动情况，动物的存活率，骨痂生成情况进行探讨研究，从而确立较为理想的失神经状态下的骨折愈合实验动物模型。 2、比较失神经状态下与正常骨折愈合过程中骨折断端刚度与强度，骨形态计量学中动力性参数与静力性参数，及骨密度的变化规律验证失神经状态对骨折愈合有重要影响作用。 3、探讨失神经状态下骨痂组织形态结构、骨钙素的表达、成骨细胞超微结构的变化，找到失神经状态下骨折愈合受到影响的原因。 4、失神经状态是否对骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达有影响，把失神经状态影响骨折愈合的研究深入到蛋白水平。 5、外源性给予神经生长因子，比较观察神经生长因子对失神经状态下骨折愈合是否有改善作用。 方法：1、建立T10脊髓完全性损伤状态下大鼠胫骨骨折模型：于脊髓T10节段横断并切除2mm脊髓，开放性折断左后肢胫骨造成骨折行髓内针内固定、石膏外固定，构建脊髓完全性损伤大鼠失神经状态下胫骨骨折模型。 2、研究重点在骨折愈合中的第4w，即编织骨向板层骨转化时期，运用大体形态观察了解骨折断端的愈合情况：骨折线清晰程度、骨痂的大小，再骨折比例及塑形情况；胫骨标本的湿重比较；X线片上计算比较外骨痂的量；CT断层扫描计算比较骨折断端的最大横截面直径以及骨痂中软骨性骨痂灰度值面积，比较骨痂生长的量及未骨化的程度。 3、骨痂骨密度对比性研究探讨失神经状态下骨折愈合的差异；三点折弯试验测定骨折断端的弯曲刚度与弯曲强度了解失神经状态下骨折断端的生物力学变化情况；骨痂不脱钙制成树脂切片进行静力学参数与动力学参数测定，比较分析失神经状下骨矿化异常变化。 4、运用HE染色法比较失神经状态下骨痂与正常骨痂组织形态学上的不同；采用免疫组织化学法比较分析骨痂中骨钙素表达程度的差异；TEM(透射电镜)比较分析脱钙骨痂中成骨细胞内的超微结构的变化，探讨失神经状态下对细胞器的影响。 5、运用Westernblot蛋白印记法动态观察失神经状态下骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原的蛋白表达。 6、神经生长因子干预性治疗脊髓损伤完全性损伤大鼠胫骨骨折，观察愈合情况。 结果：1、T10脊髓完全性横断损伤可诱导出大鼠后肢的运动感觉丧失，又不会造成严重的尿潴留、全身衰竭等情况。胫骨因为无大血管走行，减少了因依附于大血管的交感神经对骨折断端局部神经调节有作用。 2、脊髓完全性损伤下的骨折断端的骨痂明显多于正常神经支配骨折断端，且生物力学强度差，外源性给予NGF后骨折愈合情况得到改善统计学上有显著性差异(P＜0.05)。 3、生物力学证实了失神经状态下导致了骨折断端的强度与刚度等其它力学指标明显下降；骨计量学的静态参数与动态参数结果均表明失神经状态下骨折愈合中的类骨质向骨质转变出现障碍；失神经状态下骨折断端的骨密度较正常骨愈合断端低，经统计学比较有显著性差异，说明失神经状态下影响了成骨细胞的活性、钙盐的沉积。 4、组织形态学中发现失神经状态下成骨细胞数量减少，骨陷窝数少，钙盐线浅细；骨钙素免疫组化显示三组对比失神经状态下骨痂中骨钙素的阳性表达相对弱，与正常骨痂组与神经生长因子干预组均有显著性差异；TEM中观察到失神经状态下成骨细胞突起少，粗面内质网不发达，相对萎缩，且在细胞核周围出现了大量的溶酶体；神经生长因子干预的细胞中可以见到比较发达的粗面内质网，参予合成Ⅰ型胶原的高尔基体，说明神经生长因子对细胞器活性有刺激作用。 5、对1w、2w、4w、5w骨折断端的骨痂运用Westernblot蛋白印记法分析比较Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达情况结果显示无论是正常神经支配还是失神经失配骨折断端均呈现由低表达到高表达最后低表达的过程，这与骨折愈合的规律相一致。Ⅰ型胶原蛋白在骨痂初期就有表达，证实了软骨细胞也分泌Ⅰ型胶原。与正常骨折断端相比，失神经状态下的骨折愈合过程中第2w的Ⅱ型胶原高表达及第4wⅠ型胶原的相比较的低表达，都说明失神经状态下影响了Ⅰ、Ⅱ型胶原正常分泌，从而影响了骨痂的最终骨化。 6、神经生长因子对失神经状态下骨折愈合有促进与改善作用。疗效对比有显著性差异(P＜0.05)。 结论：1、T10脊髓完全性横断损伤状态下大鼠胫骨骨折模型是目前较为理想的研究失神经状态下骨折愈合模型。 2、失神经状态下导致骨折断端骨密度降低、骨痂矿化程度差、最终导致生物力学特性减弱。 3、失神经状态对骨痂中成骨细胞的细胞器功能有抑制作用，降低粗面内质网活性，最终导致骨基质的减少而影响正常的骨愈合 4、失神经状态下会导致骨折愈合后期Ⅰ型胶原的减少及Ⅱ型胶原的高表达，最终影响骨痂的钙化与骨化。 5、神经生长因子对失神经状态下骨折的愈合有促进作用。

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