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逆转录病毒介导的一氧化氮合酶基因在猫间充质干细胞中的表达

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摘要

前言

第一部分重组逆转录病毒pMSCVpuro-eNOS的构建

第二部分猫骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

第三部分逆转录病毒介导的eNOS基因在猫MSCs中的表达

结论

参考文献

贲门失弛缓症的研究进展

致谢

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摘要

[研究背景及目的]贲门失弛缓症是一种食管运动功能障碍性疾病，以下食管括约肌(loweresophagealsphincter，LES)张力增高及食管体部正常蠕动消失为特征。主要表现为对液体和/或固体食物的吞咽困难。研究表明，贲门失弛缓症患者LES肌肉本身的收缩和舒张功能是正常的，而支配LES的肌间神经丛中松弛LES的抑制性NOS神经减少或缺乏，使收缩LES的兴奋性胆碱能神经处于相对亢进状态。目前的治疗主要包括药物治疗、内镜下气囊扩张、肉毒杆菌毒素注射、开放式肌切开术和微创肌切开术等，均属姑息性治疗，各有局限性。 间充质干细胞(MesenchymalStromalCells，MSCs)是中胚层来源具有多向分化能力的干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，在一定的诱导条件下能分化为多种组织细胞。由于MSCs易于被外源基因转染且稳定表达，并且在一定的条件下可诱导分化为多种细胞，所以被认为是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞，因此骨髓MSCs已成为该领域研究的热点之一。 逆转录病毒可以感染增殖期的细胞，并且可以整合至被感染细胞的基因组中得以长期稳定表达，对宿主细胞没有毒性作用。本实验以逆转录病毒pMSCVpuro为载体，构建携带eNOS基因的重组复制缺陷型逆转录病毒表达载体，同时分离培养猫骨髓MSCs，研究eNOS在MSCs中的表达，为贲门失弛缓症的治疗提供新思路。 [实验方法]一、重组逆转录病毒pMSCVpuro-eNOS的构建 将质粒pcDNA3-eNOS转化、扩增、鉴定后，用EcoRⅠ酶切获得4.1kb的目的基因eNOScDNA片段。逆转录病毒载体pMSCVpuro用EcoRⅠ酶切后，用CIAP进行去磷酸化处理，然后与eNOScDNA片段连接。连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，利用Amp筛选抗性克隆，获得正向插入的pMSCVpuro-eNOS，对重组质粒进行测序。利用脂质体介导法将pMSCVpuro-eNOS转染Phoenix细胞包装成病毒颗粒，用NIH3T3细胞测定病毒滴度。用同样的方法构建对照病毒pMSCVpuro。PCR鉴定重组病毒是否携带目的基因。 二、猫骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及鉴定 收集猫骨髓1ml，转移至IMDM(含200U/ml肝素)离心管中。经滤网过滤，PBS漂洗后用Percoll分离液分离单个核细胞，加入低糖DMEM培养基中培养。24h后更换培养基，除去不贴壁的细胞。细胞生长达到融合时进行传代培养，培养基换成高糖DMEM培养基。通过倒置相差显微镜观察细胞形态及生长方式以及流式细胞仪检测免疫表型标记对MSCs进行鉴定。 三、逆转录病毒介导的eNOS基因在猫MSCs中的表达 分别用pMSCVpuro-eNOS和pMSCVpuro感染第一代MSCs，采用RT-PCR、WesternBlot、免疫细胞化学法检测eNOS在MSCs中的表达。分别用pMSCVpuro-eNOS和pMSCVpuro感染原代MSCs，测定原代和第六代MSCs表达产物eNOS的活性和NO的含量。 [实验结果]一、重组逆转录病毒质粒pMSCVpuro-eNOS的构建 1.成功构建了重组逆转录病毒质粒pMSCVpuro-eNOS，分别经酶切鉴定正确。将重组质粒进行测序表明，eNOScDNA测序部分与GenBank序列完全一致。证明eNOS被正确克隆至逆转录病毒载体pMSCVpuro中。 2.pMSCVpuro-eNOS和pMSCVpuro分别转染Phoenix细胞后，用嘌呤霉素筛选得到阳性克隆。测病毒滴度分别为3.6×105CFU/ml、4.2×105CFU/ml。PCR结果表明重组逆转录病毒pMSCVpuro-eNOS中携带eNOS基因。 二、猫骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及鉴定 分离得到的骨髓细胞在倒置相差显微镜下呈现成纤维细胞样形态，纺锤形或梭形，流式细胞仪检测细胞免疫表型标记显示94％表达CD44，92.6％表达CD9，仅0.1％表达CD34，证实为MSCs。 三、逆转录病毒介导的eNOS基因在猫MSCs中的表达 两种病毒分别感染第一代MSCs后，RT-PCR和WesternBlot结果证实，pMSCVpuro-eNOS感染组有eNOS的高效表达，而pMSCVpuro感染组不表达。免疫细胞化学法提示pMSCVpuro-eNOS感染的细胞胞核和胞浆中均有棕褐色物质，pMSCVpuro感染组为阴性。pMSCVpuro-eNOS感染组eNOS的活性和NO的含量明显高于pMSCVpuro感染组。 [结论]1.成功构建了携带牛eNOS全长cDNA序列的重组逆转录病毒pMSCVpuro-eNOS。 2.成功分离培养了猫MSCs。 3.重组病毒pMSCVpuro-eNOS能够高效感染体外培养的MSCs，并高效稳定表达eNOS基因，表达产物具有eNOS的生化特性。

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