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【6h】

IRF-2在胰腺癌中的功能及其对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响

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摘要

胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤。虽然近年来诊断和治疗技术不断提高，但胰腺癌病人生存状况仍不容乐观，这与胰腺癌发病机制复杂，多种基因参与调控，缺少有效的治疗靶点等有关。干扰素调控因子2(IRF-2)是干扰素调控因子家族的一员，其功能涉及免疫调节和肿瘤的发生发展。已有的研究表明，干扰素调控因子2参与了乳腺癌、黑色素瘤、食管癌等多种肿瘤的形成，但是其在胰腺癌中还未见系统性的功能研究。
　　 在本课题中，我们研究了IRF-2基因在胰腺癌中的功能，着重进行了以下四个部分的工作：(1)构建IRF-2基因RNA干扰的载体，并在胰腺癌细胞系中稳定沉默IRF-2的表达；(2)研究IRF-2对胰腺癌细胞系生长、增殖、侵袭、转移等生物学特性的影响，并进一步阐述其机制；(3)探讨胰腺癌细胞IRF-2沉默以后对吉西他滨化疗敏感性的影响；(4)结合临床数据，探讨IRF-2在胰腺癌临床样本中的表达情况，并分析IRF-2的表达与病人临床病理指标及预后的关系。
　　 第一部分：IRF-2基因siRNA载体的构建
　　 目的：构建IRF-2基因的siRNA载体，并检测其效果。
　　 方法：首先设计针对IRF-2 mRNA不同位点的特异性siRNA序列，合成寡核苷酸，然后将其连接到pBS/hU6-1载体上；选择合适的酶切位点与慢病毒载体FG12相连，琼脂糖电泳及测序鉴定。然后进行大肠杆菌转化，质粒大量抽提。获得的质粒，转染293T细胞进行病毒包装。最后用病毒感染胰腺癌细胞，检测干扰效果。
　　 结果：本实验成功构建连有IRF-2特异性siRNA序列的pBS/hU6-1载体；并成功将序列转移到FG12慢病毒载体上。在包装病毒及感染胰腺癌细胞系后，用Western blot检测，实验结果表明效果较好，成功构建了下调IRF-2表达的MIAPaCa-2和PANC-1胰腺癌细胞株。
　　 结论：成功构建IRF-2 siRNA载体，获得下调IRF-2表达的稳定胰腺癌细胞株。
　　 第二部分沉默IRF-2对胰腺癌细胞生物学特性的影响
　　 目的：研究沉默IRF-2表达对胰腺癌细胞生长、增殖、侵袭、转移等的影响。
　　 方法：在得到稳定干扰IRF-2表达的胰腺癌细胞株后，通过MTT、BrdU掺入实验、结晶紫实验、软琼脂克隆形成实验、裸鼠体内成瘤实验、细胞迁移实验、裸鼠体内转移实验等检验胰腺癌细胞系生长、增殖、侵袭、转移等生物学特点的变化，并且进一步从细胞周期改变及细胞凋亡方面阐述其机制。
　　 结果：MTT实验、BrdU掺入实验、结晶紫实验结果证实沉默IRF-2的表达抑制细胞的生长、增殖能力(P<0.05)。软琼脂克隆形成实验、裸鼠体内成瘤实验表明下调IRF-2的表达以后胰腺癌细胞株的成瘤能力明显下降。流式细胞实验表明下调IRF-2的表达后胰腺癌细胞株的凋亡比例明显上升(P<0.05)，细胞G0-G1期阻滞增加，S期细胞比例明显下降(P<0.05)。进一步实验表明下调IRF-2的表达后，与生长、增殖相关的基因：PCNA、CyclinD1明显下调；与凋亡相关的PARP、BAX、Caspase-8基因明显上调。细胞迁移实验、裸鼠体内转移实验发现下调IRF-2的表达对胰腺癌细胞系侵袭、转移没有明显影响。
　　 结论：下调IRF-2表达对于MIAPaCa-2和PANC-1胰腺癌细胞株的生长、增殖和成瘤能力有着明显的抑制作用，而这种作用是通过改变细胞周期和细胞凋亡来实现；但是下调IRF-2表达对于细胞侵袭、转移能力没有明显的影响。
　　 第三部分沉默IRF-2对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响
　　 目的：探讨沉默IRF-2以后对胰腺癌细胞吉西他滨化疗敏感性的影响。
　　 方法：MTT检测吉西他滨对胰腺癌细胞株PANC-1和MIAPaCa-2的半数有效剂量(IC50)，了解这两种细胞对吉西他滨的化疗敏感程度，选取相对耐药的细胞进一步探讨沉默IRF-2表达对细胞吉西他滨的化疗敏感性的影响。MTT检测干扰IRF-2基因后细胞对吉西他滨敏感性的变化。结晶紫实验和裸鼠移植瘤模型检测干扰IRF-2后是否增强吉西他滨对体外细胞克隆形成及体内成瘤能力的抑制作用。流式细胞技术检测沉默IRF-2基因前后细胞周期和细胞凋亡情况，Western blot检测与细胞增殖和凋亡相关基因的表达情况，并探讨可能的机制。
　　 结果：PANC-1和MIAPaCa-2细胞中均表达IRF-2基因，在PANC-1细胞中高于MIAPaCa-2细胞。不同浓度药物作用72小时，吉西他滨对PANC-1细胞的半数有效剂量为16.5±2.1μg/ml，而MIAPaCa-2细胞为5.6±1.2μg/ml(P<0.05)。接着，我们利用构建的PANC-1对照细胞和PANC-1干扰IRF-2表达的细胞，不同浓度药物作用72小时，吉西他滨对PANC-1对照细胞的IC50值为16.3±1.5μg/ml，干扰IRF-2表达的细胞IC50值为9.5±1.4μg/ml(P<0.05)，说明下调IRF-2基因表达后，PANC-1细胞对吉西他滨的敏感性显著增加。在结晶紫实验中，与对照细胞+PBS组相比，对照细胞+吉西他滨组及干扰IRF-2表达的细胞+PBS组克隆形成能力下降(P<0.05)，而干扰IRF-2表达的细胞+吉西他滨组克隆形成能力明显下降(P<0.01)。裸鼠体内成瘤实验进一步说明了下调IRF-2表达后，PANC-1细胞对吉西他滨的敏感性明显增强。同样，流式细胞技术表明，同其他三组相比，干扰IRF-2表达的细胞+吉西他滨组G1期细胞比例增加(P<0.05)，S期细胞比例降低(P<0.05)，细胞凋亡比例增高(P<0.01)；与其他三组细胞相比，干扰IRF-2表达的细胞+吉西他滨组Cyclin D1和PCNA表达水平下降，而与细胞凋亡相关的基因如切割的PARP、BAX和caspase-8增加。
　　 结论：慢病毒介导的RNA干扰技术特异性沉默IRF-2表达，增强胰腺癌细胞PANC-1对吉西他滨的化疗敏感性。
　　 第四部分 IRF-2在胰腺癌临床样本中的表达及与临床病理指标和预后的关系
　　 目的：研究IRF-2在胰腺癌临床样本中的表达情况，并分析IRF-2的表达与临床病理指标及预后的关系。
　　 方法：选取30例胰腺癌病人临床新鲜样本，利用免疫组织化学染色、蛋白免疫印迹、实时定量PCR检测IRF-2的表达情况；选取156例胰腺癌病人临床石蜡样本制作组织芯片，利用免疫组织化学染色进行评分；分析IRF-2的表达与病人临床病理参数及预后的关系，探讨IRF-2对病人临床特征及预后的影响。
　　 结果：与正常对照胰腺组织相比，实时定量PCR检测结果表明在胰腺癌中IRF-2高表达比例为66.7％；免疫组化和Western blot表明IRF-2在癌组织中高表达。组织芯片结果表明IRF-2的表达明显上调(P<0.01)，在癌组织中高表达比例为77.6％；统计分析表明IRF-2的表达与病人的TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤T分期有关：TNM分期(X2=21.297；P<0.001)；肿瘤分化程度(X2=10.197；P=0.006)；肿瘤T分期(X2=14.512；P=0.001)；U检验结果进一步确定这一结论。Kaplan-Meier生存曲线结果发现，病人总的中位生存时间为14.2月；高表达IRF-2的病人中位生存时间为11.2月；低表达IRF-2的病人中位生存时间为16.5月，差异具有统计学意义(P=0.027)；但Cox回归分析结果提示，IRF-2不是独立的预后影响因素。
　　 结论：IRF-2在胰腺癌中高表达；IRF-2的表达与病人的TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤T分期相关，有可能成为胰腺癌的预后指标和治疗靶点。

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