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髓样细胞分化蛋白88抑制乙型肝炎病毒复制的机制研究

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乙型肝炎病毒(Hepatitis B vires,HBV)属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviradae),具有独特的基因组结构及生物学特性。由HBV感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病。目前,临床上针对HBV感染的抗病毒药物主要为核苷类似物和干扰素-α(Interferon-α,IFN-α)。IFN-α的抗HBV的机制以及相关的干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的生物学功能尚未完全阐明。我们和其他实验室以前的研究结果显示,髓样细胞分化蛋白88(Myeloiddifferentiation primary response protein88,MyD88)的表达能被干扰素诱导,并且在肝肿瘤细胞中能通过激活NF-κB抑制HBV的复制。与此同时,HBV编码的聚合酶蛋白通过抑制statl的入核下调MyD88启动子活性从而抑制干扰素诱导的MyD88的表达。这些结果提示,MyD88可能在干扰素抑制ItBV复制中发挥关键作用。但是MyD88的抗病毒机制仍不甚明了,有必要进一步研究其详细的作用机制。
　　为了进一步验证MyD88的抗病毒作用,首先用MyD88重组腺病毒(Ad-MyD88)感染有稳定HBV复制的HepG2.2.15细胞,然后用Northern-blot和Southem-blot检测病毒:RNA和病毒核心颗粒相关DNA水平。结果显示,与对照相比,Ad-MyD88感染同等程度地降低了病毒RNA和核心颗粒相关DNA的水平,提示MyD88抗病毒作用的一级靶位点可能是病毒RNA,这一点随后用只能进行病毒RNA的转录而不能进行病毒基因组复制的pCIdA-HBV所证实。此外在通过小鼠尾静脉高压注射HBV复制质粒建立的急性感染模型中,MyD88也具有与在体外相似的抗病毒作用。
　　为了探讨是否MyD88在生理条件下也能发挥抗病毒作用,将MyD88 siRNA转入Huh7细胞,然后测定IFN-α的抗病毒活性。结果显示,在MyD88 knock-down细胞中,HBV对IFN-α的抗病毒作用有了一定的抵抗能力,提示MyD88在IFN-α抑制HBV复制中发挥一定作用。
　　MyD88能直接下调病毒RNA水平,这可能发生在转录水平,也可能发生在转录后水平。结果显示,MyD88对由HBV启动子和增强子调控的荧光素酶的活性没有显著影响,但是能抑制受CMV启动子启动的pregenomic RNA的水平。这些结果提示,MyD88下调病毒RNA水平是一转录后水平事件。
　　为了进一步研究MyD88转录后下调pregenomic RNA的机制,利用Tet-off系统研究MyDS8对pregenomic RNA稳定性的影响。结果显示MyD88可以降低pregenomic RNA的稳定性。进一步通过核浆分离显示,MyD88降低了pregenomicRNA在胞浆中的稳定性,但是对胞核中pregenomic RNA的稳定性没有影响。RNA干扰实验表明,MyD88对pregenomic RNA在胞浆中的降解是通过细胞中的两条mRNA降解通路即5'-3' mRNA降解通路和3'-5'mRNA降解通路进行。
　　细胞蛋白La可与HBVpregenomic RNA特异结合促进pregenomic RNA的稳定性。但是本研究显示,MyD88诱导pregenomic RNA的降解不依赖于La蛋白与pregenomic RNA的相互作用。进一步通过mapping分析发现HBV(1804-2454)和HBV(1151-1684)是MyD88的应答序列。随后以pregenomie RNA为背景,构建HBV(1804-2454)和HBV(1151-1684)的缺失突变体,然后测定它们对MyD88的敏感性。结果显示,HBV(1151-1684)的缺失突变体仍然保留着对MyD88的应答能力,而HBV(1804-2454)的缺失突变体丧失了对MyD88的敏感性,表明位于HBV pregenomic RNA5'末端的HBV(1804-2454)序列为MyD88诱导pegenomic RNA降解的一个关键的顺式作用序列。
　　RNA序列HBV(1151-1684)位于HBV pregenomic RNA和preS/S RNAs的重叠区域,因此它可能选择性赋予了preS/S RNAs对MyD88的敏感性。结果显示,RNA序列HBV(1151-1684)选择性介导了HBV preS/S RNA的降解,并且这种降解主要发生在核内。
　　有趣的是RNA序列HBV(1151-1684)与HBV转录后调控元件(posttranscriptional regulatory,element,PRE)完全重叠。HBV PRE选择性介导preS2/S RNAs出核,不能出核的RNA最后以一种未知的机制在核中降解。因此MyD88导致preS/S RNAs在核中降解可能是由于MyD88干扰了PRE介导的preS/S RNAs出核所导致。通过CAT活性分析显示,MyD88可以降低PRE介导的CAT活性,并且不是由于MyD88直接导致其在核中降解所造成,因为在PRE出核抑制蛋白NES(-)RanBP1共表达的条件下,MyD88不能进一步抑制CAT的活性,而PRE的核输出因子多嘧啶茎结合蛋白(polypyrimidne tract-bindingprotein,PTB)的表达几乎完全恢复了PRE促进出核的功能。随后通过核浆分离用Northem-blot证实了CAT活性分析的结果。因此,从以上结果可以得出MyD88抑制了PRE介导的preS2/S RNAs出核。
　　为了进一步研究MyD88抑制PRE介导的preS/S RNAs出核机制,检测了PTB的表达水平。结果显示MyD88可以同等程度地下调PRE核输出因子PTB的蛋白水平和mRNA水平,提示MyD88对PTB表达的抑制发生在PTB mRNA水平。进一步检测MyD88对PTB mRNA稳定性的影响发现,MyD88对PTBmRNA稳定性没有明显影响,提示MyD88对PTB表达水平的抑制是一转录水平事件。
　　总之,本研究进一步探讨了MyD88的抗病毒作用和机制,对该机制的阐明将有助于新的治疗乙型肝炎的药物的开发。

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