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TLR4配体脂多糖和紫杉醇对Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b+Gr-1+MDSCs的作用

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摘要

免疫疗法在肿瘤治疗中日渐兴起，然而临床效果却不令人满意，其原因之一在于肿瘤诱导的免疫耐受。研究发现肿瘤免疫耐受的产生与髓系来源抑制性细胞(MDSCs)的聚集相关。MDSCs是一类具有免疫抑制活性的细胞群体，能通过多种方式抑制机体免疫，包括表达免疫抑制活性酶类。MDSCs一旦在肿瘤微环境中发生分化受阻、聚集，将不利于机体的抗肿瘤免疫。目前关于MDSCs的产生、分化及功能的调控是肿瘤免疫学的研究重点。
　　Toll样受体4(TLR4)是重要的免疫分子，能识别细菌外膜成分脂多糖(LPS)，主要分布在髓系细胞表面，参与调节髓系细胞的免疫功能。近来有报道称在4T1乳腺癌荷瘤小鼠及正常小鼠体内的MDSCs表面也发现了TLR4表达，并认为TLR4可能是MDSCs产生、分化及功能的潜在调控靶点。细胞毒药物紫杉醇是新近发现的TLR4的潜在配体，研究认为紫杉醇可能通过调控表达TLR4的免疫细胞参与机体的抗肿瘤免疫调节，并且已在树突状细胞与巨噬细胞的相关研究中得到证实，那么，紫杉醇是否也能通过影响表达TLR4的MDSCs来调节宿主的免疫功能?并且，同样作为TLR4的配体，紫杉醇与LPS对MDSCs的作用有何异同?均有待阐明。故本课题拟首先鉴定并分选Lewis肺癌小鼠脾脏中的MDSCs，了解此来源的MDSCs上TLR4的表达状况，检测LPS及紫杉醇处理后MDSCs凋亡、成熟和免疫功能的变化，本课题的研究结果将有助于进一步阐明TLR4与MDSCs间的关系，并对紫杉醇的抗肿瘤免疫功能提供新的认识。
　　研究方法：
　　1.荧光抗体标记Lewis肺癌小鼠及正常小鼠脾脏单个核细胞，流式细胞仪(FCM)检测细胞表面分子CD11b和Gr-1、分化抗原CD11c和F4/80、组织相容性复合物MHC-Ⅱ、协同共刺激分子CD86的表达。(鉴定MDSCs的表面标志)。
　　2.利用相应的免疫磁珠分选Lewis肺癌小鼠脾脏中的MDSCs。
　　3.建立混合淋巴细胞反应体系(MLR)，体外鉴定分选所得MDSCs的免疫抑制功能。
　　4.RT-PCR检测MDSCs中TLR4基因的表达；FCM检测MDSCs表面TLR4蛋白的表达。
　　5.AnnexinV+PI法检测LPS及紫杉醇作用后MDSCs的凋亡；FCM检测Lewis肺癌小鼠腹腔注射紫杉醇后其脾脏中MDSCs比例的变化。
　　6.FCM检测LPS及紫杉醇作用后MDSCs表面组织相容性复合物MHC-Ⅱ及协同共刺激分子CD86的表达。
　　7.MLR检测LPS及紫杉醇作用后MDSCs的免疫抑制功能。
　　8.Western Blot检测LPS及紫杉醇处理后MDSCs胞内免疫抑制活性酶类精氨酸酶1(ARG1)的表达。
　　研究结果：
　　1.Lewis肺癌小鼠脾脏内CD11b/Gr-1双阳性细胞明显增多，占脾脏单个核细胞的(42.53±6.26)％。Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b/Gr-1双阳性细胞表面CD11c、F4/80、MHC-Ⅱ及CD86的表达均较正常小鼠低，分别为(11.67±3.01)％vs(24.67±4.02)％，p=0.01；(14.33±3.33)％vs(27.00±4.21)％，p=0.01；(8.66±2.33)％vs(30.00±3.51)％，p=0.001；(14.67±3.76)％vs(32.00±4.73)％，p=0.007。
　　2.免疫磁珠分选所得阳性细胞中CD11b/Gr-1双阳性细胞比例大于90％，而分选所得阴性细胞中CD11b/Gr-1双阳性细胞少于1％。
　　3.与对照组相比，包含Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b/Gr-1双阳性细胞的实验组中淋巴细胞的增殖率明显降低，(14.67±3.76)％vs(45.30±7.26)％，p=0.02。
　　4.Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b+Gr-1+MDSCs表面存在TLR4表达。
　　5.0.1gg/ml LPS或1μg/ml LPS作用48小时后CD11b+Gr-1+MDSCs的凋亡较对照组降低，分别为(9.83±2.36)％vs(23.93±4.67)％，p0.1μg/ml=0.007；(8.00±2.64)％vs(23.93±4.67)％，P1μg/ml=0.004，而不同浓度LPS组间差异无统计学意义。当LPS作用24小时后，三组间凋亡差异无统计学意义。
　　6.1μg/ml LPS作用后CD11b+Gr-1+MDSCs表面MHC-Ⅱ和CD86的表达较对照组降低，分别为(15.33±3.78)％vs(34.66±3.78)％，PMHC-Ⅱ=0.002；(18.48±3.51)％vs(31.23±3.60)％，PCD86=0.01。而0.1μg/ml LPS作用后MHC-Ⅱ和CD86的表达与对照组相比差异无统计学意义。
　　7.1μg/ml LPS作用后CD11b+Gr-1+MDSCs对淋巴细胞增殖的抑制较对照组增加，抑制率分别为(44.33±9.71)％vs(19.33±5.52)％，P1:1=0.01；(34.66±7.76)％vs(17.66±4.52)％，p1:2=0.03(1:1和1:2为CD11b+Gr-1+MDSCs在MLR中的稀释比例)。而0.1μg/ml LPS组与对照组相比抑制率差异无统计学意义。
　　8.0.1μg/ml LPS或1μg/ml LPS均能诱导CD11b+Gr-1+MDSCs胞内免疫抑制酶类ARG1表达增高。
　　9.Lewis肺癌小鼠腹腔注射20mg/kg紫杉醇后脾脏中CD11b+Gr-1+MDSCs的比例较未注射组降低，(28.64±5.45)％vs(42.58±5.06)％，p=0.03。
　　10.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs的凋亡均较对照组增加，凋亡率分别为(21.46±6.76)％vs(4.53±0.90)％，P24小时/30ng/ml=0.01；(38.96±5.47)％vs(4.53±0.90)％，p24小时/300ng/ml=0.001；(38.70±4.21)％vs(23.93±4.67)％；P48小时/30ng/ml=0.04；(55.03±6.65)％vs(23.93±4.67)％，P48小时/300ng/ml=0.009。不同浓度紫杉醇组间MDSCs的凋亡率差异具有统计学差异，P24小时=0.01、p48小时=0.02。
　　11.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs表面MHC-Ⅱ的表达分别为(36.34±5.35)％、(42.12±5.56)％，CD86的表达分别为(42.00±6.35)％、(31.12±4.83)％，与对照组相比差异均无统计学意义。
　　12.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇作用后CD11b+Gr-1+MDSCs对淋巴细胞增殖的抑制较对照组降低，抑制率分别为(12.0±4.87)％vs(25.56±6.56)％，P30ng/ml=0.04；(10.22±4.52)％vs(25.56±6.56)％，p300ng/ml=0.02。
　　13.30ng/ml紫杉醇或300ng/ml紫杉醇均不会影响CD11b+Gr-1+MDSCs胞内ARG1的表达。
　　研究结论：
　　1.与正常小鼠相比，Lewis肺癌小鼠脾脏中聚集了大量的CD11b/Gr-1双阳性细胞，且该双阳性细胞分化受阻、成熟障碍，并在体外能抑制淋巴细胞的增殖，符合MDSCs的生物特征。
　　2.Lewis肺癌小鼠脾脏来源CD11b+Gr-1+MDSCs表面存在TLR4的表达。TLR4配体LPS作用后能增加CD11b+Gr-1+MDSCs在体外的抗凋亡能力，抑制CD11b+Gr-1+MDSCs分化成熟，增加CD11b+Gr-1+MDSCs胞内免疫抑制活性酶ARG1的表达，最终增强CD11b+Gr-1+MDSCs的免疫抑制功能。
　　3.紫杉醇对CD11b+Gr-1+MDSCs的作用与LPS不一致，紫杉醇在体内外均能够杀伤CD11b+Gr-1+MDSCs，降低CD11b+Gr-1+MDSCs的免疫抑制功能，但不影响CD11b+Gr-1+MDSCs的分化成熟及其胞内免疫抑制酶ARG1的表达。

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