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【6h】

转酮醇酶活性下降及磷酸戊糖途径功能障碍参与硫胺素缺乏脑区选择性损伤的病理机制

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摘要

韦尼克脑病是由于硫胺素(维生素B1)缺乏所致的神经退行性疾病,典型的临床表现为眼肌麻痹、共济失调和脑功能异常。病变部位表现出特异的脑区选择性,主要位于中线结构脑区。韦尼克脑病脑区选择性损伤的机制至今未能明确。目前的研究认为是由于硫胺素缺乏导致硫胺素依赖的PDH和KGDH活性下降,从而引起能量代谢障碍和氧化应激造成脑组织的损伤,但是这并不能解释为什么在能量代谢更为活跃的皮层不出现损害。硫胺素依赖的另外一个酶——TK在硫胺素缺乏时亦出现明显的下调。TK是磷酸戊糖途径非氧化通路的关键酶,参与核糖核酸和还原当量如NAPDH的合成。TK活性下降会影响到核糖核酸和还原当量的合成,从而对具有增值能力的细胞造成损伤,这在肿瘤细胞的研究中已被证实。脑中线两侧的结构是细胞增值较为活跃的部位,本课题组在前期的研究中已发现小鼠硫胺素缺乏早期海马齿状回的神经发生就开始明显下调,是否硫胺素缺乏引起的TK活性下降及所致的磷酸戊糖途径功能障碍参与了这种特异性选择性损伤的机制?由此我们制备了硫胺素缺乏的小鼠模型,研究TD对小鼠脑组织硫胺素依赖酶的活性改变及硫胺素缺乏对磷酸戊糖途径功能的影响;制备。TKRNA干扰Lentivirus病毒载体,感染神经干细胞,观察TKRNA干扰以及羟基硫胺素对神经干细胞的影响。
　　 第一部分:硫胺素缺乏对硫胺素作为辅酶的相关酶活性和磷酸戊糖途径功能的影响
　　 目的:研究TD对脑内硫胺素作为辅酶的PDH、KGDH、TK活性的影响,及磷酸戊糖途径关键酶——G6PD和产物NADPH/NADP+的改变,探讨它们与TD导致的特异性脑区损害发生机制之间的关系。
　　 材料与方法:根据前述方法、饮食剥夺硫胺素制备TD小鼠模型,实验分TD9、TD14、TD21和正常对照4组,每组6只小鼠。水合氯醛麻醉后断头处死小鼠并迅速取出大脑。原位杂交研究不同脑区TK的mRNA表达。依据Stephan方法提取线粒体,BCA法测定线粒体蛋白浓度。依据Humphries等人的方法测定KGDH活性,依据Hinman等人的方法测定PDH活性,依据文献业已报道的方法测定脑组织TK和G6PD活性和NADP+、NADPH的含量,并计算NADP+/NADPH比例。每组活性检测重复三次,所有数值表示为mean±SEM,用t检验统计对照组和TD9、TD14、TD21组有无统计学差异。
　　 结果:TD9和TD14脑组织PDH和KGDH的活性无明显下降,TD14脑组织TK的活性显著下降,NADPH的含量在TD9和TD14均有显著的下降。海马TK的mRNA表达明显高于皮层。在TD9和TD14时,海马TK的活性明显下降,而海马和皮层G6PD及皮层Ⅸ活性无明显改变。
　　 结论:目前学术界普遍接受的PDH和KGDH活性下降的相关机制难以全面解释TD导致的脑中线两侧组织特异性损害和认知功能障碍的发生机理;TK活性下降导致的磷酸戊糖代谢通路功能障碍可能参与了硫胺素相关的脑中线两侧特异性脑区损害机制。
　　 第二部分:转酮醇酶RNA干扰Lentivims病毒载体的制备和筛选
　　 目的:制备TKRNA干扰Lentivirus病毒载体,感染神经干细胞,筛选最佳干扰靶点序列。
　　 材料和方法:针对TK基因序列,利用公用网站按照RIgA干扰序列设计原则,设计多个RNA干扰靶点序列,含干扰序列的双链DNA寡核苷酸,其两端含酶切位点粘端,将其直接连入酶切后的Lentivirus病毒载体上。将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,在进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰Lentivirus病毒载体。培养生长状态良好的目的细胞(即大鼠神经干细胞),目的细胞分入12-well培养板培养,感染按实验设计的组别分别加入不同MOI的RNAiLentivirus病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况,感染5天后收集细胞,采用RT-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况,进而判断不同靶点序列的干扰效果。
　　 结果:成功构建了TKRNA干扰Lentivirus病毒载体;含不同干扰序列的病毒分别感染神经干细胞,观察GFP表达情况,感染效率达50％,则用RT-PCR检测,最佳TK干扰效果达65％。
　　 结论:成功制备了TKRNA干扰Lentivirus病毒载体,对目的细胞的TK的表达有较好的干扰效果。
　　 第三部分:转酮醇酶RNA干扰和羟基硫胺素对海马神经干细胞的影响
　　 目的:用RNA干扰技术和TK抑制剂羟基硫胺素两种方法,观察抑制TK表达和/或活性对神经干细胞生长的影响。
　　 材料和方法:取E15大鼠胎鼠的海马,制成细胞悬液,用神经干细胞培养基培养。用Nestin鉴定神经干细胞。细胞培养基中加入不同浓度的TK抑制剂羟基硫胺素,继续培养1-7天,观察神经干细胞球生长,并用CCK-8及BrdU等方法检测神经干细胞增值情况。细胞悬液中加入适量的Lentivirus病毒,分为两组,一组为携带TKRNAi的Lentivirus病毒作为处理组,另一组为携带阴性RNAi序列的Lentivirus病毒作为对照组,培养3天后观察GFP表达情况,判断转染率,转染率达50％以上,则进行下一步检测。神经干细胞与病毒共培养5天后,用RT-PCR评价神经干细胞TK基因表达下调效果。观察感染病毒后神经球形成的大小、数量及迁移水平,用CCK-8评价细胞生长的情况。
　　 结果:TK抑制剂羟基硫胺素抑制神经干细胞球的生长,降低神经干细胞的增殖速度,并与抑制剂的浓度相关。TKRNA干扰Lentivirus病毒感染的神经干细胞,与对照组比较,其神经球的数量、大小、形态和迁移水平均受到影响:CCK-8的结果亦显示RNA干扰抑制了神经干细胞的增殖。
　　 结论:TKRNA干扰和抑制剂损害海马神经干细胞的增殖和生长。

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