正常人肝组织及肝癌相关WGA亲和型糖蛋白质组学研究

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蛋白质糖基化作为一种重要的翻译后修饰对蛋白质结构和功能，如对蛋白质的折叠、运输、定位和功能表达起着重要的作用。许多疾病的发生与蛋白质糖链结构异常有关。目前，糖蛋白质组学研究热点主要集中于表达蛋白质组学和比较/差异糖蛋白质组学。至今没有一个完整数据库全面阐述正常生理状态下所有糖基化的蛋白质，也未见有系统的糖蛋白质组学手段筛查病理过程相关的异常糖基化蛋白质。肝癌的血清糖蛋白中有许多糖链结构发生变化，如：唾液酸增多、N-乙酰氨基乳糖重复顺序出现、平分型GIcNAc增加等。本研究利用麦胚凝集素(WGA)能够特异性识别带有唾液酸的聚糖或带有平分型GlcNAc、N-乙酰氨基乳糖重复序列的复杂型或杂合型聚糖及相对高通量的糖蛋白质组学共性技术平台，即凝集素亲和层析、双向电泳(2-DE)胶上荧光显示联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析，初步建立了正常人肝脏组织W6A亲和型糖蛋白表达谱和数据库。同时联合应用凝集素亲和层析、2-DE、复合蛋白质组学技术(Multiplex Proteomics)、MALDI-TOF-MS/MS技术比较分析正常人肝组织和伴有转移的肝癌组织WGA亲和型糖蛋白，获得了它们的差异表达修饰谱，发现VCP protein、Prohibitin、Peroxiredoxin 2等WGA亲和型差异糖蛋白，验证了肿瘤组织中VCPprotein糖链结构发生了改变，且除了唾液酸之外还存在其他导致WGA亲和力增强的糖链结构。第一部分：正常人肝组织WGA亲和型糖蛋白数据库的构建及生物信息学分析。本部分研究旨在建立相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台，并以此为基础，建立正常人肝脏组织WGA亲和型糖蛋白表达谱和数据库，为研究健康人肝组织糖基化修饰谱奠定了基础，推动了后续的肝脏疾病比较糖蛋白质组学研究。选择30例健康人供肝的混合样本，优化组织总蛋白的提取方法，以便更充分地提取组织总蛋白。通过WGA亲和层析柱后，获取WGA亲和型糖蛋白，与总蛋白分别进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，发现通过亲和层析使得WGA结合的糖蛋白得到富集，主要集中于47KDa左右。第二部分肝癌相关的WlGA亲和型糖蛋白比较蛋白质组学研究。本部分研究在第一部分建立的糖蛋白表达全谱的技术平台上，进一步改进，引入复合蛋白质组学(MP)技术，通过凝集素亲和层析和糖蛋白染色双筛选尽量能够排除少数凝集素非特异结合的蛋白。比较正常人肝组织与伴有转移的肝癌组织WGA亲和型糖蛋白的差异，筛查与肝癌相关的异常糖基化蛋白质，旨在筛选肝癌预测、诊断标记物，为差异/比较糖蛋白质组学研究提供技术手段。从30例正常人肝组织混合样本和30例伴有转移的肝癌组织原发灶中分别提取总蛋白，层析后，进行WGA亲和和印迹、SDS-PAGE以及2-DE比较分析。结论：1．建立了两种结构糖蛋白质学技术平台：1)凝集素亲和层析、2-DE胶上荧光显示联合MALDI-TOF-MS/MS的高通量糖蛋白质组学共性技术平台；2)联合凝集素亲和层析、2-DE、MP技术以及MALDI-TOF-MS/MS技术的差异糖蛋白质组学的高效率技术平台。2．应用凝集素亲和层析、2-DE胶上荧光显示联合MALDI-TOF-MS/MS分析，初步建立正常人肝组织的WGA亲和型糖蛋白表达谱和数据库，WGA亲和型糖蛋白主要参与体内代谢过程，发挥催化反应和结合反应的作用。3．应用联合凝集素亲和层析、2-DE、MP技术以及MALDI-TOF-MS/MS技术的差异糖蛋白质组学的高效率技术平台，建立了正常人肝组织与伴有转移的肝癌组织WGA亲和型糖蛋白差异表达谱，鉴定出24种差异糖蛋白。VCP蛋白存在唾液酸化，同时也存在其他可能导致与WGA亲和力增强的糖链结构。潜应用价值：1．建立的相对稳定的高通量糖蛋白质组学共性技术平台有助于今后疾病相关的糖蛋白质组学研究，对筛选出疾病发生、发展中相关的异常糖基化蛋白质有重要价值。2．正常人肝组织的WGA亲和型糖蛋白表达谱和数据库的初步建立，为研究健康人肝组织糖基化修饰谱奠定基础。3．筛选出24种WGA亲和型差异糖蛋白，部分糖蛋白有可能成为肝癌诊断及复发预测的“糖指标”。创新点：1．本研究首次建立正常人肝组织的WGA亲和型糖蛋白表达谱和数据库。2．运用比较糖蛋白质组学技术手段从正常人肝组织与伴有转移的肝癌组织中筛出24种WGA亲和型差异糖蛋白，部分差异糖蛋白为首次报道，且首次证实了VCP蛋白除了存在唾液酸化，同时也存在其他可能导致与WGA亲和力增强的糖链结构。

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作者
卢雯静;
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作者单位

复旦大学;

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授予单位复旦大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名刘银坤;
年度 2007
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肝肿瘤;
关键词
肝组织; 肝癌; 肝肿瘤; WGA; 糖蛋白; 蛋白质组学;

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