α-突触核蛋白参与MPTP诱导帕金森病模型的关键机制及苁蓉总苷干预作用的研究

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帕金森病(Parkinson's disease，PD)是最常见的神经变性疾病之一。迄今，其发病原因和病理机制仍未完全阐明，目前仍缺乏阻止病情进展的有效措施。中国医药学是一个伟大的宝库，2000多年来，历朝历代丰富的医学书籍中，记载了治疗震颤的大量临床实践，需要进一步加以挖掘提高。因此，继续深入地探讨帕金森病的病理机制、发现新的治疗靶点，进行天然药物的筛选，具有迫切的现实意义。这也是实施创新药物和中药现代化国家战略的题中应有之义。我们在临床中发现肉苁蓉为主的方剂确实能够延缓帕金森患者需要增加左旋多巴制剂用量的时间。体外实验数据证实，其抗帕金森病的活性来自肉苁蓉的苯乙醇苷类化合物，具有很强的药理活性，能够显著抑制MPP+诱导的多巴胺能神经元凋亡。但，具体的作用靶标及作用途径尚不能用已知的机制来很好解释，限制了进一步的研究和开发。 α-突触核蛋白(α-synuclein)的发现在帕金森病研究史上具有里程碑性的重要意义，但大量的研究报告在生化和分子生物学的角度进行阐述，迄今，其亚细胞水平的分布仍没有得到详细的研究和刻画。大量的研究表明，蛋白质功能的发挥不仅与其在细胞内的结构和丰度有关，也与其在亚细胞水平的定位密切相关。蛋白质在病理状态下的改变，不仅有表达水平和结构的改变，而且往往伴有亚细胞水平的分布改变。传统观点认为，α-突触核蛋白主要在神经元的突触前终末表达。近来的研究表明，这一观点值得商榷。并且最近大量运用生化和分子生物学方法的研究显示：α-突触核蛋白与线粒体之间存在密切相关性。但是，尚没有系统的证据证实两者之间存在直接的物理联系。针对上述问题，本课题首先论证了正常黑质的多巴胺能神经元中，α-突触核蛋白与线粒体存在物理上的相关性。在证实这种相关性后，我们评价了其在MPTP模型中的潜在病理意义。并以此为重要靶点，探讨了中药肉苁蓉苯乙醇苷类提取物-苁蓉总苷抗帕金森病的可能机制。本课题的研究结果如下：一、正常小鼠黑质多巴胺能神经元的线粒体膜上存在α-突触核蛋白的表达 1、腹侧中脑组织纯化的线粒体中有α-突触核蛋白表达Westem blot分析发现在纯化的中脑线粒体中有α-突触核蛋白的表达，并提示α-突触核蛋白在线粒体上表达的现象不仅限于腹侧中脑区域，也存在于其它区域。这可能是α突触核蛋白阳性神经元的共有现象。 2、α-突触核蛋白在黑质区域的分布及与COX Ⅳ蛋白的共定位我们采用荧光三标的方法对黑质区域进行了研究，结果显示，在正常小鼠的黑质致密部神经元中，酪氨酸羟化酶与α-突触核蛋白完全共定位，在黑质网状部存在少量体积较小的神经元呈α-突触核蛋白免疫反应阳性，但无酪氨酸羟化酶的表达。这说明在腹侧中脑区域内，α-突触核蛋白的表达主要在黑质致密部的多巴胺能神经元。接下来我们进行了α-突触核蛋白与细胞色素c氧化酶亚单位IV(COX Ⅳ)在黑质致密部共定位的研究，后者通常用来作为线粒体的标志物。我们采用激光共聚焦显微镜100×的油镜进行观察，融合图像的黄色区域显示了α-突触核蛋白与COX Ⅳ黑质致密部神经元中存在共定位。COX Ⅳ蛋白绿色免疫荧光的斑点状高亮区与α-突触核蛋白红色免疫荧光的斑点状高亮区吻合，在融合图像中形成高亮的黄色斑点，这可能提示在正常神经元中存在少量线粒体形成的聚集，而且这种聚集的结构与α-突触核蛋白共定位。 3、双标免疫电镜结果我们采用包埋前双标免疫电镜技术进行研究。发现部分银增强的胶体金颗粒的确存在于线粒体的外膜上，在线粒体的脊和基质中则未发现α-突触核蛋白的免疫反应性。非酪氨酸羟化酶免疫反应阳性的区域未见到银增强的胶体金颗粒。二、MPTP对小鼠黑质神经元线粒体上α-突触核蛋白表达的影响 1、MPTP对α-突触核蛋白表达的影响 Weatern blot的分析结果显示：在第一次MPTP注射后12小时，α-突触核蛋白在胞浆成分中的表达显著升高(P<0.01)，我们继续观察至首次注射后的10天(末次注射后的6天)，其间的各时间点都未见显著升高。而在纯化的线粒体中α-突触核蛋白的表达在第一次MPTP注射后12小时出现升高(P<0.05)，第2天时(第二次MPIP注射后24小时)达到顶峰，以后直到第7天都处于一个相对平台期，第10天降低接近正常。 2、MPTP诱导线粒体的聚集与α-突触核蛋白共定位我们采用免疫荧光双标激光共聚焦显微镜观察的方法研究α-突触核蛋白与线粒体的标志物COX IV的表达。结果发现，在第一次MPTP注射后12小时，很多细胞中，α-突触核蛋白的免疫荧光明显增强，分布扩展至包括核区的整个胞体；24小时，黑质致密部神经元中线粒体结构聚集在核的周围，并且α-突触核蛋白的定位与COX IV的物理定位完全重叠。此后，从2天到7天仍有一些神经元中α-突触核蛋白的免疫荧光增强，大部分神经元中出现与α-突触核蛋白共定位线粒体聚集现象。免疫双标电镜并没有在线粒体的脊或基质中见到大量的银增强的胶体金颗粒。大部分α-突触核蛋白的免疫反应还是出现在线粒体膜上。 3、MPTP诱导线粒体的减少和变性免疫电镜发现，在MPTP处理3天后的脑片中，很多酪氨酸羟化酶阳性神经元的内质网肿胀断裂，线粒体明显减少，残存的线粒体出现脊断裂、肿胀、以及空泡化。尽管胞体的核周区线粒体减少，但在一些酪氨酸羟化酶阳性神经元突起的近端却聚集有大量的线粒体。三、苁蓉总苷对MPTP小鼠的干预作用研究 1、对神经行为的影响在MPTP第一次注射后7天和14天测试，模型组小鼠爬杆时间明显延长，与正常组相比统计有显著意义(P<0.01)。与模型组相比，苁蓉总苷各组的爬杆时间均有改善；但只有苁蓉总苷高剂量组与模型组相比，统计有显著差异(P<0.01)。 2、对纹状体酪氨酸羟化酶阳性纤维的影响我们分别于第一次MPTP注射后的7和14天，运用免疫组织化学的方法观察了苁蓉总苷对纹状体酪氨酸羟化酶阳性纤维的影响，结果显示3个剂量组的苁蓉总苷在两个时间点上均能明显提高纹状体酪氨酸羟化酶的表达。 3、肉苁蓉苯乙醇苷类提取物对黑质致密部多巴胺能神经元数量的影响我们分别于第一次MPTP注射后的7和14天，运用免疫组织化学的方法观察了苁蓉总苷对黑质致密部的酪氨酸羟化酶阳性神经元数量的影响，结果显示，模型组在MPTP第一次注射后7和14天酪氨酸羟化酶阳性神经元数量与正常对照组相比下降，统计有显著意义(P<0.01)。三个剂量组苁蓉总苷的干预均能对抗MPTP导致的酪氨酸羟化酶阳性神经元的数量的下降，但只有苁蓉总苷高剂量组在两个时间点上与模型组比较能达到统计学上的显著性(P<0.05)，并且与正常对照组相比，差别不显著(P>0.05)。 4、苁蓉总苷对α-突触核蛋白表达的影响我们观察了高剂量苁蓉总苷对黑质致密部神经元α-突触核蛋白表达的影响，发现，小鼠经MPTP处理后，黑质致密部α-突触核蛋白的免疫反应明显增强，呈强阳性的神经元明显增多(P<0.01)，统计显示，经高剂量苁蓉总苷干预的模型小鼠，其α-突触核蛋白强阳性的神经元与模型组小鼠相比明显减少(P<0.01)。小结：我们的研究表明在正常小鼠黑质神经元的线粒体膜上存在α-突触核蛋白的表达。MPTP可以诱导这种表达的升高。MPTP小鼠模型中可能存在标志线粒体凋亡的聚集现象。并且可能线粒体上增高的α-突触核蛋白的表达促进了这种聚集现象。苁蓉总苷可以有效的改善MPTP小鼠模型的神经行为，抑制MPTP诱导的小鼠死亡。这种干预作用可能与其抑制了线粒体上增高的α-突触核蛋白的表达有关。

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作者
李文伟;
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作者单位

复旦大学;

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授予单位复旦大学;
学科中西医结合临床(神经病学)
授予学位博士
导师姓名蔡定芳;
年度 2007
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类神经系统药物;各科用药;
关键词
帕金森病; 肉苁蓉; 病理机制; 药理活性;

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