拟南芥(Arabidopsis thaliana)受胁迫因子诱导激活启动子的筛选及其应用研究

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植物因其不可运动性导致不能主动逃避有害刺激去寻求理想的环境。这使植物只能全力忍耐环境。根据环境的变化来调整生理生化途径甚至发育方向是植物体得以生存的主要手段和特征。植物的许多抗逆基因的表达属于诱导调控类型。即:当受到某一环境因素的胁迫时,植物会启动这些胁迫相关基因的表达,胁迫消失时基因就会关闭。这种胁迫诱导型的启动子在植物基因工程中应当具有广泛的潜在用途。本研究课题目的是希望从植物中筛选、分离受胁迫因子诱导激活的启动子,通过对其核苷酸序列的分析鉴定它们的特异性元件,并将各种特异性元件组装起来形成一种能定时、定量和定点驱动目的基因表达的新型诱导型启动子,以满足植物学基础研究和基因工程的实际应用需求。
　　主要实验结果如下:
　　 1.本研究课题中,我们采用了一种新型的分子生物学差异显示方法来筛选拟南芥(Arabidopsis thaliana)受Cd2+诱导表达的基因。总共有19条差异条带被分离出来,它们代表着18个基因。其中6个基因的胁迫诱导表达特性通过RT-PCR的方法得到确认:它们显著地受到Cd2+诱导表达。这6个基因包括LEA(胚胎发育晚期丰富蛋白),AtGSTF2(谷胱甘肽-S-转移酶2),AtGSTF6(谷胱甘肽-S-转移酶6),AtHsp70(热激蛋白70),AtsHsp17.6B-C1(17.6 kDa类型1小分子热激蛋白)和AtsHsp17.6-C2(17.6 kDa类型2小分子热激蛋白)。这些基因的获得为我们进一步深入研究植物耐受Cd2+胁迫机制提供了基础。
　　 2.我们获得的受Cd2+诱导表达的三个热激蛋白基因AtHsp70、AtsHsp17.6B-C1和AtsHsp17.6-C2,在未受胁迫的营养组织中表达量很低,但在Cd2+胁迫下,基因表达量迅速提高9～16倍以上。除Cd2+之外,其它一些重金属,如Ni+、Pb2+、Cu2+、Zn2+和Al3+均能诱导这三个热激蛋白基因表达。氧化胁迫、高温胁迫和水分胁迫均能诱导这三个热激蛋白基因表达,表明它们能被许多逆境所诱导。它们的启动子是多胁迫响应的启动子。过量表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6B-C1能够有效提高植物对6μM Cd2+胁迫、0.4％NaCl胁迫的耐逆性和基础耐热性,推测其能够减轻或抵抗逆境胁迫引起的伤害并对其进行修复。
　　 3.利用小分子热激蛋白基因AtHSP17.6-C2与GUS基因融合的热诱导表达系统,在拟南芥最适生长温度(22℃)下,植物的营养组织中基本上检测不到GUS酶活性。当温度升高到34-37℃时,GUS基因表达水平迅速提高。实验结果表明,37℃是该系统的最适诱导温度。这个温度也是常用的植物热驯化温度,使用这个温度短时间内处理植物将不会造成伤害。在34-37℃温度范围和0-2小时处理时间范围内,GUS酶活性随着温度的升高和热激时间的延长而提高,具有明显的剂量效应关系。据此,我们可以通过控制热激处理温度和时间来控制AtHsp17.6-C2启动子的诱导活性。我们对转化子()F1-22-13经一次热激处理后,随着恢复培养过程(22℃下)的进行,GUS酶活性在5小时时达到最高,然后开始下降；但24小时后仍然达到最高活性的73％。多次热诱导处理(37℃下处理60分钟)能够重复有效地激活AtHsp17.6-C2启动子,并且对植物生长没有明显影响。因此,可以通过重复多次热诱导处理来获得相对稳定的基因表达。
　　本论文主要创新点:
　　 1.我们利用一种新型的基于ACP(annealing control primer)技术的分子生物学差异显示方法建立在各种生理或实验条件下,鉴别植物体中差异表达的基因的实验平台,以便研究和分析这些基因的生物学功能,探讨如何应用这些基因。
　　 2.初步证明过量表达小分子热激蛋白基因AtsHsp17.6B-C1能够有效提高植物对某些胁迫的耐逆性。
　　 3.初步构建了一个高效的可调控的植物基因热诱导表达系统。

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作者
曾卫军;
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作者单位

华东师范大学;

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授予单位华东师范大学;
学科植物学
授予学位博士
导师姓名王水平;
年度 2010
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类协迫生理学;植物基因工程;
关键词
拟南芥; 引物退火控制; 热激蛋白; 启动子; GUS活性; 胁迫基因表达; 基因工程;

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