密码子优化的人生长素基因在大肠杆菌及人生长素基因在毕赤酵母中表达的研究

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人生长激素(hGH)是由人的脑垂体前叶合成分泌的一种非糖化蛋白类激素，在人体生长发育方面起着极其重要的作用。人生长激素的主要生理功能是促进人体生长发育和维持组织器官的正常功能，如果缺乏就会产生侏儒症及组织器官的萎缩和功能衰竭。除此之外，人生长激素还可用于烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、骨质疏松以及过渡肥胖等疾病的辅助治疗。为了提高hGH在大肠杆菌中的表达量，在不改变氨基酸序列的前提下，对编码hGH的序列进行了密码子优化，构建了原核重组表达载体，以期能够降低成本。同时，由于毕赤酵母表达系统在重组蛋白表达方面的许多优点，研究了目的基因在毕赤酵母中的表达情况，建立了毕赤酵母表达系统的平台，为工业化的生产奠定了基础。本论文的主要内容有三个部分： 1.密码子优化的人生长素基因的全基因合成及克隆。 2.密码子优化的人生长素基因在大肠杆菌中的表达。 3.人生长素基因在毕赤酵母中的分泌表达。结果及结论如下： 1.根据人生长素基因的氨基酸序列，选择大肠杆菌所偏好的密码子，人工设计并合成了20个寡核苷酸片断。通过重叠区扩增法，利用PCR成功地合成了人生长激素基因的全序列。经克隆测序，证明我们已成功地实现了人生长素基因的合成及克隆。 2.T克隆测序正确后，利用NdeⅠ及BamHⅠ分别双酶切表达载体pET-22b和目的片断，构建pET-hGH*表达载体，转化BL21(DE3)表达菌，IPTG诱导，提取周质蛋白，SDS-PAGE、放射免疫鉴定蛋白的表达。结果发现目的蛋白表达量不仅没有得到提高，反而表达量非常低甚至是不表达，优化各种表达条件，蛋白表达量均没有得到提高。于是换用pINIII-ompA3表达载体，同时对5'密码子进行了替换，重新构建了pINIII-ompA-hGH*表达载体，转化BL(21)表达菌，37℃发酵15h，经SDS-PAGE及放射免疫测定，蛋白表达量得到了很大提高，BandScan凝胶扫描软件分析目的蛋白约占总蛋白的25％左右，放射免疫测定蛋白表达量约为18mg/L左右。因此可以初步得出结论：密码子设计需要进一步优化。同时，密码子优化只是影响蛋白表达量的一个因素，质粒拷贝数、基因二级结构、蛋白稳定性、翻译效率、培养条件以及蛋白表达载体的选择等都与蛋白表达水平有关。 3.用PCR技术从质粒pCDNA3.0/hGH扩增得到hGH基因。将其插入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K/hGH，转化毕赤酵母GS115，筛选出整合了多拷贝人生长激素基因的菌株，经摇瓶培养，0.5％甲醇诱导表达。SDS-PAGE分析显示，表达产物以可溶性分子形式存在于上清中，诱导4d的表达量达到高峰。放免表明：表达产物表达量约为18mg/L左右。

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作者
卢希彬;
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作者单位

华东师范大学;

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授予单位华东师范大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名戴平,郭礼和;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 Q575.11;
关键词
蛋白表达; 密码子优化; 毕赤酵母; 分泌表达; 人生长激素;

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