多表位融合HCV抗原的构建与双抗原夹心检测anti-HCV可行性研究

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研究目的:anti-HCV检测对于控制HCV经输血传播,及时诊断HCV感染患者发挥了巨大的作用.目前所用第三代ELISA检测试剂较早期试剂在灵敏度和特异性上都有了很大提高,但在检测低感染率(<10﹪)人群时特异性仍不理想,阳性结果人群中约35﹪(15﹪-60﹪)为假阳性,在献血员中阳性结果的预示值仅为70-80﹪,造成了医疗资源和宝贵血源的很大浪费.双抗原夹心法在方法学上比目前所用间接法特异性更好,灵敏度更高,该研究旨在建立双抗原夹心anti-HCV ELISA检测方法,以解决间接法特异性不足问题.研究内容:1.多表位融合重组HCV抗原基因的克隆与序列分析.选择HCV结构蛋白和非结构蛋白优势抗原表位的编码基因,以及来自HCV不同病毒型别的抗原表位编码基因共12个,拼接成长度为1450bp的嵌合抗原编码序列,插入pQE-30和pinpoint T表达载体,分别转入M15和JM109(DE3)工程菌,应用PCR扩增和测序证实插入序列具有正确的编码序列和正确阅读框架.2.多表位融合重组HCV抗原的表达、纯化与活性鉴定.将M15和JM109(DE3)工程菌诱导表达显示,融合蛋白在M15中以包涵体形式表达,带有6×组氨酸标签;在JM109中可溶性表达,氨基端带有生物素化的标签.表达蛋白经亲和纯化后分别测定各抗原表位的分片段抗原性和生物素标签的亲和素结合活性.结果表明重组蛋白抗原性完整,可以用于anti-HCV的检测;生物素标签具有良好的亲和素结合活性,可用作ELISA检测的信号放大系统.3.Anti-HCV舣抗原夹心ELISA法的建立及效果评价.用His-tagged-HCV抗原包被酶联板,以可溶性表达的biotin-tagged-HCV作为夹心抗原,Streptavidin-HRP用作显色用酶标记物建立了双抗原夹心法.应用结果显示,方法具有极好的特异性,400份阴性血清无一例假阳性;临床350份间接法检测阳性的标本中,有12份标本双抗原夹心法检测阴性,这12份标本经RT-PCR及RIBA确证试验均为阴性.

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作者
李保昌;
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作者单位

解放军军事医学科学院;

中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所;

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授予单位解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所;
学科免疫学
授予学位博士
导师姓名王全立;
年度 2004
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类免疫分子生物学（免疫化学）;
关键词
丙型肝炎病毒; ELISA; 抗体; 嵌和抗原;

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