仿刺参体壁中抗菌肽的分离纯化及抗菌活性研究

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本文以鲜活仿刺参为原料，以抗菌活性为指标，采用乙酸浸提法和有机溶剂浸提法提取仿刺参体壁中的多肽。选用单因素结合响应面法优化浸提参数，得到浸提参数的最佳值。采用超滤法制备出3种不同分子量的组分，并检测其对大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抗菌活性。以抗菌活性为指标，进行大孔吸附树脂及高速逆流色谱(HSCCC)分离纯化，最后选用高效液相色谱仪（HPLC）分析得到的抗菌肽。主要研究工作如下: 1.仿刺参体壁中多肽的提取和参数优化以得率为指标，采用响应面法优化浸提液浓度、液料比和离心转速。最终得到两种提取方法的最佳条件，乙酸浸提法为:乙酸浓度6.28%，液料比1:1（v:v），离心转速8540r/min，最高得率2.803%，验证此条件下的实际得率是2.78%。有机溶剂浸提法为:甲醇浓度80%，液料比5.46:1（v:v），离心转速为8081r/min，最高得率为1.87%，验证该试验条件下的实际得率为1.82%。测定两种粗提物的多肽含量时选用双缩脲法（Biuret colorimetry），结果分别为:2.28mg/mL和1.50 mg/mL。 2.结合切向流超滤方法制备不同分子量的梯级肽及测定梯级肽的抗菌活性采用超滤法将乙酸粗提物和甲醇粗提物分别分成3个肽段，分子量依次为5～10kD、1～5kD和<1kD，而当超滤进行到第4次就可以将分子量不相同的肽段分离。采用酶标仪比浊法检测各组分对大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性，绘制各菌的24h内的生长曲线，比较各组分的抗菌效果，得到结论为:由乙酸粗提物超滤得到的<1kD的组分对四种菌株的抗菌活性最好。 3.仿刺参体壁中抗菌肽的分离纯化及抗菌活性测定采用大孔吸附树脂层析进一步分离纯化由乙酸粗提物超滤得到的<1kD的组分，选用25%、50%、75%和95%的无水乙醇做洗脱剂，各自得到一个洗脱峰，分别记为F1、F2、F3和F4，同样采用酶标仪比浊法检测各峰的抗菌活性并进行比较，得出F3抗菌活性较好。用Tricine-SDS-PAGE测其分子量结果为: F3样品在分离胶上表现为单一条带，分子量4.35kD。选之进行HSCCC，并比较了甲基叔丁基醚:乙腈:正丁醇:1%三氟乙酸（2:1:1:4，v:v）和正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（3:7:5:5，v:v）两种溶剂体系对F3的分离纯化效果，结果发现，正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水（3:7:5:5，v:v）溶剂体系对F3的分离纯化效果较好。具体试验条件为:上样量25mg，流速1mL/min，转速850r/min，温度25℃。将F3分成3个峰（T1、T2、T3），其中T1为F3的主成分。选用HPLC法分析T1，结果发现T1由5种化合物组成。

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作者
孟春英;
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作者单位

上海海洋大学;

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授予单位上海海洋大学;
学科食品工程
授予学位硕士
导师姓名王茂剑;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类水产养殖技术;水产基础科学;
关键词
仿刺参; 体壁; 抗菌肽; 分离纯化;

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