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大珠母贝、珠母贝和草莓海菊蛤基因克隆与一达分析

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大珠母贝(Pinctadamaxima)和珠母贝(P.margaritifera)隶属于软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，珍珠贝科(Pteriidae)，珠母贝属(Pinctada)。大珠母贝俗称白碟贝，主要分布于我国的海南省、雷州半岛及澳大利亚、东南亚沿岸海域，属热带、亚热带海洋的双壳贝类，是生产海水珍珠的最大贝类，所产珍珠为闻名遐迩的南洋珠，是最名贵的珠宝。珠母贝俗称黑蝶贝，分布于太平洋和印度洋的热带海域，我国海南岛、雷州半岛和台湾沿海亦有分布，该贝能育出世界上罕见的黑珍珠，也是目前唯一能批量生产黑珍珠的贝类。草莓海菊蛤(Spondylusfragum)隶属于软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，海菊蛤科(Spondylidae)，海菊蛤属(Spondylus)，分布于菲律宾以及中国大陆的广东、海南等地，常见于浅海及潮间带低潮线附近的岩石及珊瑚礁上。该物种的模式产地在菲律宾。本研究：(一)、克隆了大珠母贝Prismalin-14cDNA(pmaxPrismalin-14)序列及其3’端基因组序列，并对其进行了序列结构分析和组织表达分析，对比了大珠母贝和合浦珠母贝(P.fucata)Prismalin-14蛋白的碳酸钙沉降抑制效果并探究了其原因；(二)、克隆了珠母贝组织蛋白酶D(CathepsinD，CD)全长cDNA，命名为pmarCD，并对其进行了序列分析和组织表达分析；(三)、克隆了草莓海菊蛤α-淀粉酶(α-amylase)全长cDNA，命名为sfAMY，并对其进行了序列分析和组织表达分析。主要研究结果如下：
　　 1.利用已知大珠母贝EST文库扩增得到大珠母贝Prismalin一14cDNA序列，该序列全长379bp，包括5’非编码区(UTR)24bp，3’非编码区(UTR)13bp，开放阅读框(ORF)339bp，编码由113个氨基酸组成的多肽，推测分子量约为12.7kDa，理论等电点为4.239，其N-端的16个氨基酸肽段为信号肽。
　　 2.选取编码大珠母贝pmaxPrismalin-14基因的ORF序列插入pET-32a质粒构建表达载体，通过IPTG诱导，亲和层析柱纯化，成功获得预期大小的融合蛋白。碳酸钙沉淀抑制实验表明大珠母贝的pmaxPrismalin-14蛋白同样具有抑制碳酸钙沉淀的功能。
　　 3.组织特异性表达表明大珠母贝pmaxPrismalin-14基因在外套膜的表达远高于其它组织，对大珠母贝外套膜三个不同部位的荧光定量PCR表明，pmaxPrismalin-14基因在大珠母贝外套膜边缘表达最高，外套膜皮质部和外套膜中心表达较低。
　　 4.利用RT-PCR和PACE技术克隆了珠母贝pmarCD基因，该序列全长1840bp，5'非编码区(UTR)长151bp，3‘非编码区(UTR)长516bp，开放阅读框(ORF)长1170bp，编码390个氨基酸，推测分子量为42.18kDa，理论等电点为6.354，存在转录终止序列AATAAA和polyA尾，其N-端的18个氨基酸肽段为信号肽序列。组织表达显示pmarCD基因在各个组织中均有表达，在性腺和肝胰脏中的有较高表达。
　　 5.利用RT-PCR和RACE技术克隆了草莓海菊蛤sfAMY基因，该序列全长1717bp，5'非编码区长89bp，3‘非编码区长98bp，开放阅读框(ORF)长1527bp，编码509个氨基酸，推测分子量为56.98kDa，理论等电点为7.484，存在转录终止序列AATAAA和polyA尾巴。组织表达显示sfAMY基因在肝胰脏、性腺和肌肉中有表达，其中在肝胰脏中表达量最高。

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