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团头鲂野生群体、驯养群体、遗传改良群体的遗传变异

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摘要

绪论

第一章 利用5’锚定PCR技术分离团头鲂微卫星标记

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二章 团头鲂野生群体、驯养群体、选育群体遗传变异分析

第一节 微卫星分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二节 线粒体DNA分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

本章小结

第三章 团头鲂“浦江1号”选育后期世代群体同野生群体间遗传变异分析

第一节 微卫星分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二节 线粒体DNA分析

1 材料和方法

2 结果

3．讨论

本章小结

第四章 不同倍性团头鲂群体的遗传变异分析

第一节 微卫星分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

第二节 线粒体DNA分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

本章小结

全文结论

附录 (文献综述) 团头鲂种质资源的研究进展

参考文献

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致谢

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摘要

团头鲂（Megalobrama amblycephala）是草食性鱼类，自然分布局限于长江中、下游的一些大、中型湖泊中。自上世纪50年代在湖北省淤泥湖、梁子湖等被发掘为养殖对象以来，由于肉质好和草食性等优点，推广到全国的许多地方进行养殖，已成为中国主要淡水养殖品种之一。长期以来，由于过度捕捞、水域污染、水利工程建设等原因，团头鲂的天然资源已遭严重破坏并趋衰竭。但在另一方面，团头鲂人工繁殖技术的突破，虽极大地促进了团头鲂养殖业的发展，但也从此带来了对天然基因库的干扰。团头鲂经过18年选育，才产生了一个优良品系——“浦江1号”，在“浦江1号”基础上，通过人工诱导又获得了多倍体群体，这些遗传改良群体的遗传变异程度以及从天然群体到遗传改良群体和人工繁殖群体遗传多样性的变化趋势和规律，都是值得关注的新课题。因此，从遗传多样性的角度，开展团头鲂的遗传资源的调查和研究已成当务之急。本研究分别采用微卫星标记和线粒体DNA标记技术对我国团头鲂自然分布区的4个野生群体、2个代表性驯养群体、3个选育良种后期世代群体(“浦江1号”选育系F7，F8，F9)、1个选育奠基群体(F0)以及人工多倍体群体（团头鲂同源四倍体、倍间正交三倍体、倍间反交三倍体和倍间异源三倍体）的遗传结构进行了较为深入的比较研究，探讨了从野生群体到驯养群体以及遗传改良群体遗传多样性的变化趋势。主要研究结果如下:
　　1.团头鲂微卫星标记的分离
　　本研究旨在为团头鲂遗传变异的检测以及遗传图谱的构建等奠定技术基础。采用5'锚定PCR技术开发团头鲂基因组微卫星资源。以团头鲂基因组DNA为材料，设计9条5'锚定引物，经PCR扩增富集微卫星序列，将产物连接入pMD19-T载体，转化Top10感受态细胞后，从转化平板上随机挑取白斑，PCR法验证为阳性克隆后，选取含有不同长度插入片段的阳性克隆，送生物公司测序。结果表明，①共获得450个菌，经菌液PCR检测后得到219个阳性克隆，对这219个阳性克隆进行测序，共获得522个特异微卫星位点，其中包括442个二核苷酸重复的微卫星位点，4个三核苷酸重复的微卫星位点，以及76个四核苷酸重复的微卫星位点。②微卫星重复单元包括AG/TC，TG/AC，TA/AT，TGA，CAT，GAT，GAGT和GATA，其中以AG/TC和TG/AC为单位的重复序列占了绝大多数，分别为326个(62.45％)和136个(26.05％)。③重复次数主要集中在5～10次，占66.67％，最高重复数为28次。其中，两端型重复类型的微卫星有356个(68.20％)，居间型重复类型的微卫星有166个(31.80％)。在单一型标记中，完美型占91.19％，非完美型为5.75％，复合完美型标记占3.07％。④选取重复次数大于12次的居间型微卫星序列用于引物设计，共设计58对引物用来进行PCR扩增，有25对能扩增出特异条带，其中10对具有多态性。⑤将开发的10个多态性微卫星标记应用于两个团头鲂群体的扩增结果显示，梁子湖野生群体和选育良种“浦江1号”F7群体中各位点等位基因数分别为3～17（平均值为8.00）和3～13（平均值为6.50）;期望杂合度分别为0.5786～0.9556（平均值为0.7923）和0.4899～0.9355（平均值为0.7222）。表明这10个微卫星标记适合作为检测团头鲂群体遗传变异的分子标记。
　　2.团头鲂野生群体、驯养群体、选育群体遗传变异的微卫星分析
　　以团头鲂的4个野生群体[分别采自梁子湖(LZ)、淤泥湖(YN)、石首(SS)和监利（JL）]、2个驯养群体[分别采自湖北公安(GA)和天津换新(HX)]、以及1个选育良种“浦江1号”F7群体(PJ)，采用17个微卫星标记进行了群体遗传多样性与遗传分化研究。结果表明，①7个群体的平均等位基因数（A）为4.88～7.65，平均有效等位基因数（Ne）为3.20～5.33，平均观测杂合度(Ho)为0.6985～0.9044，平均期望杂合度（He）为0.6501～0.7805;平均多态信息含量（PIC）为0.5706～0.7226;群体间遗传分化指数(FST)范围为0.0307～0.1451;群体间Nei标准遗传距离(Dn)为0.0938～0.4524。②在He方面，4个野生群体间差异不显著（P＞0.05），2个驯养群体均显著地(P＜0.05)低于3个野生群体，但与一个野生群体差异不显著(P＞0.05);2个驯养群体间差异不显著（P=0.792），“浦江1号”群体低于4个野生群体，高于2个驯养群体。③在FST值方面，4个野生群体间差异不显著（P＞0.05），2个驯养群体之间、以及它们与“浦江1号”群体间FST值差异均达到显著性水平(P＜0.05)。④研究结果揭示经历7代科学选育后，团头鲂选育群体的杂合度比野生群体有所降低，但相对于其它驯养群体仍保留了较高的遗传多样性。从野生群体到驯养群体或到选育群体的遗传变异和分化，可为鱼类种质资源的保护和利用提供重要的判据。
　　3.团头鲂野生群体、驯养群体、选育群体遗传变异的线粒体DNA分析
　　通过对线粒体DNA控制区和COⅡ基因序列的联合分析，进一步研究了团头鲂的4个野生群体、2个驯养群体和1个选育良种“浦江1号”F7群体的遗传多样性和遗传分化关系。结果表明:①在所分析的1509bp片段中，4种核苷酸(T、C、A、G)的平均含量分别为29.0％、24.1％、31.7％和15.2％。②核苷酸变异类型有转换、颠换、插入/缺失4种。确定了64种单倍型，群体间无共享单倍型。③4个野生群体内线粒体DNA的单倍型多样度(H)在0.857～0.943之间，核苷酸变异位点数在31～40之间，核苷酸多样性指数（π）在0.275％～0.461％间，平均核苷酸差异数(K)的范围为4.043～6.800，线粒体DNA核苷酸序列间的平均遗传距离在0.0028～0.0046之间;2个驯养群体的相应参数变化范围分别为0.714～0.800,18～21,0.122％～0.175％,1.800～2.586,0.0012～0.0018,均低于野生群体;选育群体的相应参数分别为0.843，23，0.193％，2.843，0.0019，低于四个野生群体，但高于2个驯养群体。以上5种多样性参数在7个群体中的变化趋势一致，即LZ＞SS＞JL＞YN＞PJ＞HX＞GA。④七群体之间的平均遗传距离在0.0006～0.0035之间，遗传分化指数(Fst)在0.0109～0.1331之间。4个野生群体间Fst值差异不显著(P＞0.05)，而2个驯养群体间Fst值差异显著(P＜0.05)，它们与选育群体间的Fst值差异也显著(P＜0.05)。⑤用UPGMA法和NJ法构建的7个团头鲂群体的聚类树基本一致，聚类结果显示，七群体团头鲂明显分成两大支。4个野生群体与公安驯养群体聚为一个大支，“浦江1号”F7群体与换新驯养群体(HX)聚为另一支。
　　4.团头鲂“浦江1号”选育后期世代群体同野生群体间遗传变异的微卫星分析
　　以团头鲂人工选育良种群体（“浦江1号”选育系F7、F8、F9，3个）为实验组，野生群体（梁子湖和淤泥湖，共2个）以及选育奠基群体（F0，1个）为对照组，用17个微卫星标记进行了群体遗传多样性与遗传分化研究。结果表明，①6个群体的平均等位基因数（A）为5.71～7.65，平均有效等位基因数(Ne)为3.79～5.33，平均观测杂合度(Ho)为0.8170～0.8603，平均期望杂合度（He）为0.7126～0.7805;平均多态信息含量（PIC）为0.6188～0.7226;群体间遗传分化指数（FST）范围为0.0312～0.1229;群体间Nei标准遗传距离（Dn）为0.0928～0.3694。②在He方面，从高到低依次为，梁子湖野生群体、淤泥湖野生群体、选育奠基群体、选育系F7、选育系F8和选育系F9，2个野生群体间差异不显著(P=0.072)，3个选育群体间差异也不显著(P＞0.05);3个选育群体显著(P＜0.05)低于梁子湖(LZ)野生群体;选育奠基群体(F0)与2个野生群体间差异均不显著(P＞0.05)。③在FST值方面，2个野生群体间FST值差异不显著（P＞0.05），3个选育群体间FST值差异也不显著（P＞0.05），但它们与野生群体及奠基群体间的FST值差异显著(P＜0.05)，奠基群体与2个野生群体间差异不显著(P＞0.05)。④基于Dn值构建的6个群体NJ和UPGMA聚类图基本一致，6群体分为明显的两大组，野生群体（LZ和YN）和奠基群体聚为一组，不同选育后期世代群体（F7，F8和F9）聚为另一组。⑤研究结果揭示，经历20多年的9代系统选育后，相对于野生群体，团头鲂“浦江1号”良种已产生了明显的遗传分化，性状已相当稳定，但离选育极限尚有一定距离。
　　5.团头鲂“浦江1号”选育后期世代群体同野生群体间遗传变异的线粒体DNA分析
　　通过对线粒体DNA控制区和COⅡ基因序列的联合分析，进一步研究了团头鲂人工选育良种群体、野生群体及选育奠基群体的遗传多样性和遗传分化关系。结果表明:①在所分析的1509bp片段中，4种核苷酸(T、C、A、G)的平均含量分别为29.0％、24.1％、31.7％和15.2％。②核苷酸变异类型有转换、颠换、插入/缺失4种。确定了38种单倍型(haplotype)，2个野生群体间无共享单倍型，它们与奠基群体及3个选育群体间也无共享单倍型。共享单倍型产生在3个选育群体间，F7、F8及F9三群体间有7个共享单倍型。③2个野生群体内线粒体DNA的单倍型多样度（H）在0.857～0.943之间，核苷酸变异位点数在31～40之间，核苷酸多样性指数（π）在0.275％～0.461％间，平均核苷酸差异数(K)的范围为4.043～6.800;3个选育群体的相应参数变化范围分别为0.809～0.843，21～23，0.179％～0.193％，2.621～2.843，均低于野生群体;选育奠基群体的相应参数分别为0.852，30，0.258％，3.982，低于2个野生群体，但高于3个选育群体。以上4种多样性参数在6个群体中的变化趋势一致，即LZ＞YN＞F0＞F7＞F8＞F9。④六群体之间的平均遗传距离在0.0008～0.0032之间，遗传分化指数(Fst)在0.0213～0.1028之间。2个野生群体间Fst值差异不显著（P=0.0693），3个选育群体间Fst值差异也不显著(P＞0.05)，但它们与野生群体及奠基群体间的Fst值差异显著(P＜0.01)。⑤用UPGMA法和NJ法构建的6个团头鲂群体的聚类树基本一致，聚类结果显示，六群体团头鲂明显分成两大支。野生群体（LZ和YN）和奠基群体聚为一支，不同选育后期世代群体(F7，F8和F9)聚为另一支。
　　6.不同倍性团头鲂群体遗传变异的微卫星分析
　　以本实验室所研制的不同倍性团头鲂群体（团头鲂同源四倍体、倍间正交三倍体、倍间反交三倍体、倍间异源三倍体以及二倍体“浦江1号”）为对象，利用多态性微卫星DNA标记研究多倍体育种对鱼类遗传多样性和遗传分化可能产生的影响，为阐明某些自然拟四倍体物种（如鲤、虹鳟等）的起源提供理论依据。主要研究结果:①17对微卫星引物在不同倍性团头鲂五群体中探测到的等位基因数共有115个，大小在102～331bp之间。②不同倍性团头鲂五群体内的Shannon多样性指数在0.2571～0.3842之间，Nei's基因多样性指数在0.1680～0.2511之间，平均遗传距离在0.3443～0.5045之间;五群体间的Nei's标准遗传距离在0.0504～0.1895之间，成对FST值范围为0.0548～0.3773，均达到显著性水平（P＜0.05），表明不同倍性团头鲂各群体间均发生了显著的遗传分化。③Shannon多样性指数和Nei's基因多样性指数在五群体间的变化趋势一致，即:同源4n-F1＞反交3n＞正交3n＞2n＞异源3n，而且，同源4n-F1、反交3n以及正交3n群体的Shannon多样性指数(SHpop)和Nei's基因多样性指数均显著地(P＜0.05)大于异源3n群体。④对五群体微卫星标记遗传变异的分子方差分析和聚类分析的结果表明:不同倍性团头鲂五群体间出现显著的遗传分化，分子系统树分成明显的两支，同源4n-F1、正交3n、反交3n和2n为一支，异源3n为另一支。
　　7.不同倍性团头鲂群体遗传变异的线粒体DNA分析
　　通过对线粒体DNA控制区和COⅡ基因序列的联合分析，进一步研究了不同倍性团头鲂群体的遗传多样性和遗传分化关系。结果表明:①在所分析的1509bp片段中，4种核苷酸(T、C、A、G)的平均含量分别为29.0％、24.1％、31.7％和15.2％。②核苷酸变异类型有转换、颠换、插入/缺失4种。确定了52种单倍型，群体间无共享单倍型，五群体的单倍型多样度(H)在0.843～0.850之间，说明不同群体内单倍型类型丰富。③不同倍性团头鲂五群体内的核苷酸多样性指数（π）在0.193％～0.239％之间，平均核苷酸差异数(K)在2.843～3.754之间，变异位点数在23～28之间;五群体之间的双参数平均遗传距离在0.0017～0.0029之间，遗传分化指数(FST)在0.0614～0.1494之间。各群体两两间均发生了显著分化（P＜0.05）。④变异位点数、单倍型多样度（H）、核苷酸多样性指数(π)及平均核苷酸差异数(K)这4个遗传参数在5个群体间的变化趋势一致，按从大到小的顺序依次为:反交3n＞异源3n＞正交3n＞同源4n-F1＞2n。⑤对线粒体序列变异的分子方差分析和聚类分析的结果表明:不同倍性团头鲂五群体间出现显著的遗传分化，分子系统树分成明显的两支，2n、同源4n-F1、异源3n和反交3n为一支，正交3n为另一支。

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