慢加急性肝衰竭动物模型免疫抑制机制探讨及TNF-α在继发二次感染模型中的作用研究

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本文对慢加急性肝衰竭动物模型免疫抑制机制探讨及TNF-α在继发二次感染模型中的作用进行了研究。本研究分为两个部分：
　　第一部分：慢加急性肝衰竭动物模型免疫抑制机制探讨。
　　目的：本课题组已成功建立了刀豆蛋白A5次重复刺激模拟慢加急性肝衰竭免疫抑制状态动物模型，此模型与临床上慢加急性肝衰竭病人的免疫状态紊乱非常相似。免疫抑制与慢加急性肝衰竭病人高发二次细菌感染及高死亡率有密切关系。本研究欲对刀豆蛋白A5次重复刺激模拟慢加急性肝衰竭动物模型的免疫抑制形成机制做初步探讨。具体的实验步骤：1）本人已熟练掌握刀豆蛋白A5次重复给予建立慢加急性肝衰竭动物模型的方法，模型建立熟练，稳定性高；2）探讨髓系抑制细胞免疫抑制功能及数量；3）探讨髓系抑制细胞诱导慢加急性肝衰竭免疫麻痹的形成机制。
　　方法：⑴制作刀豆蛋白A5次重复刺激模型：C57BL/6小鼠每隔48小时一次给予球后内眦静脉丛注射刀豆蛋白A15mg/kg，共5次，建立慢加急性肝衰竭动物模型；对照组给予等体积生理盐水重复5次注射。观察小鼠的一般状态和生存情况。⑵检测髓系抑制细胞的聚集情况：在每次注射刀豆蛋白A后12小时，用流式细胞仪检测髓系抑制细胞在小鼠各脏器的绝对数量和百分比。⑶检测髓系抑制细胞的免疫抑制功能：在末次给予刀豆蛋白A48小时后，取模型小鼠髓系抑制细胞在体外与CD4+T淋巴细胞共培养，用流式细胞仪检测在体外其对 CD4+T淋巴细胞的免疫抑制功能；将模型髓系抑制细胞分选出过继给刀豆蛋白A致急性肝损伤小鼠，12小时后通过检测小鼠肝功能损伤情况，鉴定髓系抑制细胞对CD4+T淋巴细胞的抑制功能。⑷髓系抑制细胞表达MHCII、PD-L1水平，CD4+T淋巴细胞表型和调节性T细胞的数量。在第5次刀豆蛋白A注射48小时后，用流式细胞仪检测：髓系抑制细胞MHCII、PD-L1的表达；CD4+T淋巴细胞PD-1、CTLA-4、CD62L表达水平和凋亡情况；调节性T细胞的绝对数量和百分比。
　　结果：①慢加急性肝衰竭诱导的髓系抑制细胞在体内外均具有抑制CD4+T淋巴细胞的功能。②髓系抑制细胞在慢加急性肝衰竭模型脏器中聚集，其中在脾脏和骨髓中以髓系来源的粒细胞为主。③髓系抑制细胞MHCII表达降低，PD-L1表达升高。④CD4+T淋巴细胞抑制性分子PD-1、CTLA-4表达上调，凋亡增加；CD4+T淋巴细胞表达CD62L下降；调节性T细胞在肝脏中聚集。
　　结论：探讨了刀豆蛋白A5次重复给予小鼠模拟慢加急性肝衰竭的免疫抑制状态是由髓系抑制细胞在脾脏和骨髓中大量聚集及调节性T淋巴细胞在肝脏大量聚集导致。髓系抑制细胞通过自身低表达MHCII和高表达PD-L1，通过诱导CD4+T淋巴细胞高表达PD-1、CTLA-4、凋亡增加并通过诱导CD4+T低表达CD62L等机制，介导其在慢加急性肝衰竭中免疫抑制状态的形成。
　　第二部分：TNF-α在慢加急性肝衰竭继发二次感染动物模型的作用研究。
　　目的：慢加急性肝衰竭表现出和sepsis（脓毒症）一样的免疫抑制，极其容易并发二次细菌感染；慢加急性肝衰竭的病程进展与感染密不可分，感染是其常见的急性诱发因素；感染与慢加急性肝衰竭高死亡率密切相关。本课题组已初步建立慢加急性肝衰竭继发腹腔大肠杆菌二次感染动物模型，本研究欲在此感染模型基础上进一步研究促炎因子TNF-α在此模型中的作用。
　　方法：⑴制作继发二次感染动物模型与大肠杆菌最低致死量确定：刀豆蛋白 A重复5次球后内眦静脉丛注射建立慢加急性肝衰竭动物模型，在此基础上给予小鼠腹腔注射大肠杆菌建立继发二次感染模型；对照组给予等体积生理盐水。观察各组小鼠的生存率和一般情况。⑵肝脏病理切片制备和外周血炎性因子检测：在腹腔注射大肠杆菌24小时取小鼠肝脏，制作成石蜡病理切片。小鼠腹腔注射大肠杆菌后3、12、24、48、72、96小时，取外周血，离心后用流式细胞仪CBA技术检测IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ、MCP-1水平。⑶TNF-α受体阻断剂（益赛普）对继发二次感染模型的作用：提前16小时给各组小鼠腹腔注射益赛普，后注射大肠杆菌。观察各组小鼠生存率，并记录体重和一般情况。分组情况如下：刀豆蛋白A*5+大肠杆菌+益赛普、刀豆蛋白A*5+大肠杆菌、生理盐水*5+大肠杆菌+益赛普、生理盐水*5+大肠杆菌。⑷检测髓系抑制细胞胞内TNF-α表达水平：48小时后取模型组小鼠各脏器，用流式细胞仪检测髓系抑制细胞胞内TNF-α表达水平。
　　结果：①确定了慢加急性肝衰竭继发二次感染的大肠杆菌的最低致死剂量以及慢加急性肝衰竭继发二次感染小鼠的肝脏病理损伤相对轻微。②慢加急性肝衰竭继发二次感染小鼠促炎因子和抗炎因子水平均显著高于对照组（生理盐水*5+大肠杆菌），其中以促炎因子TNF-α的升高及变化尤为明显。③用TNF-α受体阻断剂（益赛普）阻断TNF-α后，慢加急性肝衰竭继发大肠杆菌感染小鼠（刀豆蛋白A*5+大肠杆菌+益赛普）生存率显著高于对照组（刀豆蛋白A*5+大肠杆菌、生理盐水*5+大肠杆菌+益赛普、生理盐水*5+大肠杆菌）。④髓系抑制细胞胞内TNF-α染色结果显示慢加急性肝衰竭髓系抑制细胞来源的粒细胞TNF-α表达水平明显升高。
　　结论：确定了慢加急性肝衰竭继发感染动物模型中大肠杆菌的最低致死剂量，其免疫状态处于更为强烈的全身炎症反应；其中促炎因子TNF-α在二次感染模型中的免疫损伤发挥重要作用，且其主要来源于髓系抑制细胞的粒细胞。

著录项

作者
张楠楠;
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作者单位

上海交通大学;

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授予单位上海交通大学;
学科临床检验诊断学
授予学位硕士
导师姓名汪铮;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肝功能衰竭;
关键词
肝功能衰竭; 炎症反应; 免疫损伤; 细胞病理学;

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