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绿色荧光蛋白启发的发光体系的构建及其光学性质研究

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第一章 绪论

1.1 引言

1.2 绿色荧光蛋白

1.3 核心生色团及其类似物

1.4 本论文的研究目的、主要内容和意义

第二章 自受限绿色荧光蛋白生色团类似物

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 荧光增强的氮杂内酯生色团的合成及光学性质研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 基于亚水杨基苯胺的荧光纳米粒子用于单激发多色细胞成像

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4本章小结

第五章 绿色荧光蛋白启发的荧光聚合物

5.1 引言

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 绿色荧光蛋白启发的多色荧光聚合物

6.1 引言

6.2 实验部分

6.3 结果与讨论

6.4 本章小结

第七章 全文总结与展望

7.1全文的主要内容和结论

7.2工作展望

参考文献

致谢

攻读博士期间发表或投寄的学术论文

声明

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摘要

绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）以其独特的光学性质，受到人们格外的关注，并在细胞生物学及分子生物学等领域有着广泛的应用。通过非基因工程的方法，采用化学合成手段制备具有类似GFP光学性质的荧光染料或发光材料，具有重要的科学意义。在过去的十几年里，有机化学家发展了多种制备GFP生色团（GFP chromophore，GFPc）及其类似物的方法，合成了一系列的模型化合物。通过对这些模型化合物的研究，加深了人们对GFPc光物理性质的理解，也促进人们发展了多种基于物理包埋或化学改性增强GFPc类似物荧光的方法。然而，如何模拟GFP的发光原理，获得类似GFP光学性质且荧光性能优异的发光体系，依然是一个巨大的难题和挑战。在本论文中，受GFP发光原理的启发，我们设计和开发了一系列新颖的具有类似GFP光学性质的发光体系，系统地研究了它们的光学性质，并初步探讨了其潜在的应用。本论文共分七个章节，具体研究内容和结论概括如下：
　　1．自受限绿色荧光蛋白生色团类似物
　　受β-筒状结构的限制效应，GFPc处于受限环境中，从而以荧光的方式释放激发态的能量。在溶液中，如果β-筒状结构被破坏，GFPc不再显示出任何荧光。如何增强GFPc在溶液中的荧光性能，并获得单分子的多色荧光，无疑充满了挑战。在本章中，受GFP发光原理启发，我们通过分子设计和改性，使生色团自身产生类似β-筒状结构的限制效应，定义为自受限效应，实现了从分子水平增强其在溶液中的荧光性能。将GFP核心生色团进行系统的化学修饰和筛选，我们获得了一系列具有自受限效应的GFPc类似物。这些类似物具有明亮的荧光，并显示出显著的溶剂化荧光变色性质，形成了从蓝色到黄色的发光色板，并伴随着98 nm的最大位移。同时，在非质子溶剂中，其荧光量子效率和寿命随着溶剂极性的增加而变大。通过理论计算，证明了自受限效应起源于2,5位烷氧取代基的强供电效应，表明其分子机理是限制了围绕CC键的自由运动。理论计算还进一步表明，溶剂分子和生色团氮杂环氧原子的静电相互作用能够限制围绕C=C双键分子运动产生的非辐射跃迁。
　　2．荧光增强的氮杂内酯生色团的合成及光学性质研究
　　GFPc氮杂内酯生色团通常不具有荧光，故其光学性质相关研究往往被研究者所忽视。制备荧光性能增强的GFPc氮杂内酯生色团，并实现单分子的多色荧光，具有重要意义。在本章中，我们分别利用自受限效应及增加共轭长度的方法，构建了氮杂内酯生色团2,5-MeOBDO和PDO，并对其光学性质进行了研究。首先，我们通过增加共轭长度的方法，用芘取代了苯环，制备了生色团PDO。实验表明，PDO在不同溶剂中的荧光性能出现了少许提高，随着溶剂极性增加，其荧光量子效率逐渐降低。同时，在不同溶剂中，PDO的荧光发射峰位移变化较小。其次，利用自受限效应，我们也制备了生色团2,5-MeOBDO。由于具有自受限的性质，2,5-MeOBDO显示出增强的荧光性能和显著的溶剂化荧光变色性质，形成了从蓝色到黄色的发光色板。在非质子溶剂中，其荧光量子效率都超过了20%，并在DMSO中达到最大，为30.7%。实验结果表明，基于自受限的2,5-MeOBDO具有比PDO更优异的光学性能。这样，我们选择了2,5-MeOBDO，进一步研究了氢键及聚集对其荧光性质的影响。最后，通过吸收光谱和荧光光谱，我们尝试将2,5-MeOBDO用于多巴胺的检测。
　　3．基于亚水杨基苯胺的荧光纳米粒子用于单激发多色细胞成像
　　受β-筒状结构对生色团自由运动的限制，GFP通过激态质子转移的性质，获得了明亮的绿色荧光。如何利用分子运动受限发光和激态质子转移机制，简易地制备具有良好荧光性能的发光体系，无疑具有很大挑战。在本章中，通过缩合反应，我们绿色、高效地制备了亚水杨基苯胺（Salicylideneaniline，SA）衍生物，结合自组装方法，实现了SA衍生物荧光性能的增强，并将其应用于单激发多色细胞成像。在混合溶剂中自组装后，SA衍生物形成了H-或J-型聚集体，从而限制了分子运动，提高了其荧光性能。由于具有分子内激态质子转移的性质，我们分别获得了具有绿色、黄色和橙色荧光的纳米粒子。同时，随着H-聚集体向J-聚集体的转变，绿色荧光纳米粒子又可以显示出黄绿色的荧光。由于亚胺键的存在，多色荧光纳米粒子具有pH响应性，其荧光强度在酸性条件下迅速衰减。此外本文还证实了基于亚水杨基苯胺或其衍生物的纳米粒子具有双光子荧光。通过与磷脂复合，多色荧光纳米粒子具有很好的水溶性和低毒性，可以应用于单激发多色细胞成像。
　　4．绿色荧光蛋白启发的荧光聚合物
　　目前，对GFP及GFPc类似物的研究都局限在生物或有机小分子相关领域，并没有将其与合成高分子有机地结合起来。GFP本身是一个基于聚氨基酸的生物大分子，以其独特的方式获得了优异的荧光。采用大分子自组装的策略，模拟GFP的发光原理，将GFPc类似物引入高分子研究领域，具有重要的学术价值和科学意义。基于此，在本章中，我们利用原子转移自由基聚合（Atom transfer radical polymerization，ATRP）及开环聚合的方法，分别制备了模拟GFP的荧光聚合物PEG-c-PMMA和PEG-c-PCL，并对其光学性质进行了考察。研究表明，在有机良溶剂中，高分子化对GFPc光学性质影响很小；自组装形成复合胶束后，荧光聚合物的荧光性能得到了显著提高，并出现了明显的红移现象。这些实验结果主要是大分子对GFPc自由旋转的限制及生色团之间或生色团与聚合物链之间相互作用增强所导致。最后，我们将这些性能增强的荧光聚合物应用于细胞成像，显示了这类新型聚合物良好的应用前景。
　　5．绿色荧光蛋白启发的多色荧光聚合物
　　GFP及其变种，连同其它被发现的荧光蛋白，形成了可以覆盖整个可见光区域的调色板，并提供了基于多色荧光标记的强有力工具。因此，制备模仿GFP的多色荧光聚合物，无疑既吸引人又充满挑战。在本章中，结合大分子自组装及化学改性GFPc的策略，我们设计和发展了荧光性能增强的多色荧光聚合物，并将其应用于单激发多色细胞成像。采用ATRP法和点击反应，我们制备了具有不同疏水链段长度的荧光聚合物PEG-c0-PMMA。自组装成胶束后，其荧光性能得到了增强，且随着PMMA链段的延长进一步提高，这要归因于生色团自由运动的限制及聚合物链的分割效应。进一步化学改性生色团，利用增加共轭长度及分子内激态质子转移（Excited-state intramolecular proton transfer，EISPT）的性质，我们成功获得了多色荧光聚合物。由于结构相似，在同一激发光照射下，这些荧光聚合物展现出蓝色到橙色的多色荧光，并伴随202 nm的最大斯托克斯位移。荧光聚合物的最大量子效率接近8%，这相比于GFPc提高了80多倍。采用共组装的方法，控制荧光聚合物的共组装比例，可以有效调控荧光发色。最后，我们将这些荧光聚合物应用于单激发多色细胞成像，有利于提高分析的准确性和可靠性。

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