角膜内皮增殖和电纺膜构建角膜内皮层的研究

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第一部分、嘌呤核苷酸促进兔角膜内皮细胞增殖及相关机制研究
　　目的：探索嘌呤核苷酸促进兔角膜内皮细胞（corneal endothelial cells，CECs）增殖的作用及相关信号通路
　　方法:
　　1.分离培养兔角膜内皮细胞，CCK-8和Ki-67免疫荧光染色检测不同浓度AT P(1μM,10μM,25μM,50μM，and100μM)对兔角膜内皮细胞增殖的影响。
　　2.CCK-8检测不同浓度UTP(1μM,10μM,25μM,50μM,and100μM)对兔角膜内皮细胞增殖的影响。
　　3.CCK-8检测多种嘌呤受体激动剂、抑制剂，PI3K-AKT通路抑制剂对兔角膜内皮细胞增殖的影响。
　　4.Western blot检测各种嘌呤核苷酸及抑制剂对P2Y2-PI3K-AKT通路中关键蛋白AKT磷酸化的影响。
　　结果:
　　1.10μM ATP促兔角膜内皮细胞增殖效果最佳，25μM ATP效果次之。
　　2.大于等于10μM浓度的UT P都能促进兔角膜内皮细胞增殖。
　　3.多种P2Y2受体激动剂也能促进兔角膜内皮细胞增殖，非P2Y2受体激动剂不能促进兔角膜内皮细胞增殖，P2Y2受体抑制剂和P2Y2-P I3K-AKT通路抑制剂能阻断ATP的促增殖效果。
　　4.各浓度AT P都能促进P2Y2-P I3K-AKT中关键蛋白AKT的磷酸化，并且磷酸化持续1小时以上。多种P2Y2受体激动剂也能促进AKT的磷酸化，P2Y2受体抑制剂和P2Y2-PI3K-AKT通路抑制剂能则阻断磷酸化作用，起到抑制增殖的作用。
　　结论:ATP及P2Y2受体激动剂作用于P2Y2受体后激活P2Y2-P I3K-AKT通路，促进AKT磷酸化从而促进兔角膜内皮细胞的增殖。
　　第二部分、SF/P（LLA-CL）混合电纺膜应用于角膜内皮层构建的研究
　　目的:初步探讨丝素蛋白(SF)与聚乳酸己内酯(P(LLA-CL))混合静电纺丝膜在角膜内皮层构建中的作用
　　方法:
　　1.从蚕蛹中分离提纯丝素蛋白,与P(LLA-CL)进行不同比例混合（100:0,75:25,50:50,25:75,0:100），静电纺丝制备纳米薄膜材料。
　　2.扫描电镜检测不同比例的静电纺丝薄膜材料的表面形态及纳米纤维直径。测量不同比例薄膜材料的亲水角、机械强度及透光率。
　　3.将人角膜内皮细胞系HC EC-B4G12细胞接种到不同比例的薄膜材料上，检测细胞在不同比例材料上的黏附速度、细胞活力与增殖能力以及材料的细胞安全性。
　　4.将HC EC-B4G12细胞接种到薄膜材料上进行长时间培养，检测内皮细胞呈单层生长情况，细胞间紧密连接形成情况及内皮功能相关蛋白基因的表达情况。
　　结果：
　　1.不同比例SF与P(LLA-CL)混合后都能电纺丝形成白色薄膜材料。
　　2.不同比例混合静电纺丝膜表面纳米纤维直径不同，纯SF纤维最细，纯P(LLA-CL)纤维最粗；亲水角随着P(LLA-CL)含量增高而增加；25:75,0:100两个比例电纺膜机械性能最佳；25:75比例电纺膜透光率最佳。
　　3.电纺膜的纳米纤维表面能有效促进HC EC-B4G12细胞的黏附，内皮细胞在各个比例混合的电纺膜中细胞活力良好，电纺膜对细胞无毒性，其中25:75比例电纺膜对细胞的增殖影响最小。
　　4.各个比例混合的电纺膜上HC EC-B4G12细胞都能正常生长，并且呈单层生长，细胞间连接形成良好，大多数内皮细胞功能相关基因表达无变化，材料局部降解会增加碳酸氢根泵基因的表达。
　　结论：一定比例混合丝素蛋白和P(LLA-CL)制备静电纺丝膜，可以得到械性能强和透光率高的薄膜支架材料，材料的纳米级表面能促进细胞黏附，对内皮细胞正常生长及单细胞层的形成无影响，对功能蛋白的基因表达无影响，是一种潜在的角膜内皮层修复支架材料，为进一步的深入研究、开发提供一定理论与实验基础。

著录项

作者
陈俊曌;
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作者单位

上海交通大学;

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授予单位上海交通大学;
学科眼科学
授予学位博士
导师姓名范先群,傅瑶,谷平,葛盛芳,李瑾;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类角膜移植;感官;
关键词
嘌呤核苷酸; 角膜内皮细胞增殖; 角膜内皮层; 静电纺丝膜; 丝素蛋白; 聚乳酸己内酯;

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