人类脐带源性的间质干细胞减轻了缺血再灌注损伤引发的急性和慢性肾脏损伤

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第一部分
　　人类脐带源性的间质干细胞经内分泌途径减轻由缺血再灌注损伤引发的急性和慢性肾脏损伤
　　目的
　　评估人类脐带源性的间质干细胞(WJ-MSCs)能否减轻缺血再灌注损伤(IRI)导致的急性和慢性肾脏损伤并探讨其背后潜在的机制。
　　方法
　　建立IRI动物模型，实施右肾切除，左肾缺血45分钟;IRI后立即经尾静脉注入含或不含2×106细胞的无血清培养基(SFM)0.5ml;在遭受IRI后2天或22周时牺牲动物，分别测定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)值;2天时，肾小管细胞的增殖、凋亡以及细胞内Akt信号的活化通过免疫组织化学染色(IHC)评估;实时荧光定量PCR(RT-PCR)用来确定肾组织样本中抗炎因子白介素-10(IL-10)和血红素氧化酶-1(HO-1)以及肝细胞生长因子(HGF)的基因表达;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清和细胞上清液中的人HGF水平;急性损伤后22周时发生的肾纤维化经组织胶原染色(Masson'stri-chromestaining)、旺-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色以及胶原定量(Sircolcollagenassay)确定。
　　为确定输注细胞在体内分布，体外BrdU标识的细胞在IRI后即刻注入，分别在2、24或48小时后牺牲动物;获取各脏器组织提交IHC(BrdU和人核有丝分裂器抗原(NuMA)染色）用于细胞定位;为确定细胞作用途径，在损伤后立即经腹腔或静脉注入含或不含细胞的SFM0.5ml，24或48小时后采集血清测定Scr和BUN水平。
　　结果
　　IRI后2天时出现急性肾功能衰竭，在细胞干预下，肾功能明显改善;组织学上，细胞治疗促进了小管细胞增殖并抑制其凋亡;此外，小管细胞内的Akt信号也得到显著强化;研究还发现细胞治疗引发肾组织中抗炎因子IL-10和HO-1以及HGF表达上调;此外，在细胞上清液和细胞治疗动物的血清中均探测到人HGF;在损伤后22周时，细胞干预改善了肾功能并减轻肾纤维化、阻止小管细胞向间质表型(α-SMA)的转化。
　　在细胞输注后2、24或48小时，BrdU标识细胞仅在肺部探测到，肝、脾和肾脏均未探测到细胞存在;利用NuMA染色进行细胞定位得到了相同的结果;在损伤后24或48小时，WJ-MSCs，无论是腹腔注射还是静脉注射，均显著改善了肾脏功能。
　　结论
　　WJ-MSCs经内分途径减轻了IRI引发的急性和慢性肾脏损伤;由细胞投递的外源性HGF和诱导宿主细胞合成的内源性HGF是其效应的潜在机制之一。
　　第二部分
　　人类脐带源性间质干细胞通过诱导受损大鼠肾小管上皮细胞合成同种和异种肝细胞生长因子减轻缺血再灌注损伤引发的肾纤维化
　　目的
　　基于前期文献，研究试图从全新的角度来揭示人类脐带源性的间质干细胞(WJ-MSCs)减轻急性肾损伤(AKI)引发的慢性肾纤维化的机制，即诱导受损的肾小管上皮细胞(TECs)合成肝细胞生长因子(HGF)。
　　方法
　　通过单侧肾脏缺血1小时建立AKI动物模型:2天后，经尾静脉注入含或不含2x106细胞的无血清培养基(SFM)0.5ml或实施对侧肾脏切除手术;在不同干预治疗后1天、1周、4周或6周时分别牺牲大鼠;肾脏纤维化经Masson'stri-chromestaining和Sircolcollagenassay进行评估;α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相对E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达上调(免疫蛋白印迹(westernblot)和免疫组织化学染色(IHC))用来提示肾小管上皮细胞向间质表型的转化(EMT);HGF和转化生长因子β1(TGF-β1)的基因和蛋白表达分别经实时荧光定量PCR(RT-PCR)和westernblot确定;HGF在肾组织中的表达部位经IHC确定;在体外，TECs暴露于低氧环境(5％O2)1小时后与来自WJ-MSCs的条件培养基(CM)或SFM共同孵育1、3、24或48小时;由TECs合成或释放的大鼠或人类HGF经RT-PCR、IHC或ELISA确定。
　　结果
　　细胞投递或对侧肾脏的切除明显减轻了损伤肾的纤维化;在AKI初始阶段（1周时），通过诱导HGF表达，细胞治疗或肾脏切除引发患肾组织内HGF相对TGF-β1的表达显著上调;大鼠TECs不仅是表达HGF的主要细胞而且在细胞治疗或肾切后，TECs内的HGF表达明显强化;在AKI的纤维化阶段（4周或6周时），细胞干预或肾脏切除阻止HGF对TGF-β1表达的下调，并藉此阻止了EMT;在体外实验中，CM与遭受低氧损害的TECs共同孵育24或48小时后，强力诱导了TECs内大鼠HGF基因表达的上调，同时促进了TECs释放HGF;此外，在共同孵育3小时后，在TECs内探测到人HGFmRNA的存在;在24或48小时后，人类HGF蛋白出现在大鼠TECs中。
　　结论
　　在AKI背景下，WJ-MSCs延缓了损伤触发的肾小管上皮细胞的EMT进程，并籍此减轻了肾脏纤维化;在AKI初始阶段，异种间质干细胞(WJ-MSCs)通过诱导受损宿主TECs合成同种及异种HGF促进了急性肾损伤修复、减轻了其后的慢性肾损伤并藉此恢复了肾纤维化期间HGF和TGF-β1间的平衡，是WJ-MSCs抗纤维化效应的重要机制之一。

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作者
杜涛;
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作者单位

上海交通大学;

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授予单位上海交通大学;
学科外科学(泌尿外科)
授予学位博士
导师姓名刘国华;
年度 2013
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肾疾病;
关键词
肾脏损伤; 间质干细胞; 肾脏纤维化; 肝细胞生长因子; 转化生长因子β1; 缺血再灌注损伤;

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