核糖核苷酸还原酶M2亚基在结肠直肠癌及紫外线诱导的DNA损伤修复中的重要作用

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目的：
　　研究核糖核苷酸还原酶M2在结肠直肠癌发生发展中的作用及紫外线诱导的直肠结肠癌细胞DNA损伤修复中的作用机制。
　　方法：
　　 (1)应用免疫组化染色技术（Immunohistochemical staining）对组织芯片(Tissue microarray)进行染色，观察核糖核苷酸还原酶M2（RRM2）在结肠直肠癌组织中的表达;应用逆转录聚合酶连反应(PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术分别观察核糖核苷酸还原酶M2在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。
　　 (2)培养HCT116，SW480和SW620等七株结肠直肠癌细胞株，细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖，流式细胞仪V-FITC（异硫氰酸荧光素）/腆化丙啶(PI)双标记法对不同处理的细胞进行细胞周期和凋亡的分析。
　　 (3) Transwell小室实验评估转染后结肠直肠癌细胞迁移能力和侵袭能力。
　　 (4)将经过不同处理的细胞置于254nm紫外线灯的照射下，观察下调/抑制核糖核苷酸还原酶M2表达后细胞对紫外线辐射的敏感度。
　　 (5)短发卡RNA(shRNA)干扰并下调RRM2的表达，分别观察真核生物胞质伴侣素(chaperonin containing TCP1 complex，CCT)ζ-1和Polo-样激酶1(PLK1)的表达情况。免疫共沉淀( Coimmunoprecipitation，Co-IP)技术观察CCTζ-1，PLK1和RRM2三个蛋白之间的相互关系。
　　结果：
　　 (1)结肠直肠癌组织中RRM2的表达明显高于癌旁正常组织(P＜0.05)，且与浸润深度(P＜0.05)、低分化程度(P＝0.0051)、TNM分期(P=0.0015)均具相关性;
　　 (2) HCT116细胞中RRM2呈现高表达，下调RRM2表达后，其增殖能力较对照组明显下降(P＜0.05)
　　 (3)在迁徙实验中，RRM2干扰组穿膜细胞数为（11±2）个，低于阴性对照组[(29±4)个]和空白对照组[(23±3)个](P＜0.01）。在侵袭试验中，RRM2干扰组穿膜细胞数为（81±3）个，低于阴性对照组[(289±7)个]和空白对照组[（301±7.2）个](P＜0.01)。
　　 (4)下调核糖核苷酸还原酶M2表达后结肠直肠癌细胞对紫外线辐射的敏感度增强。
　　 (5)短发卡RNA(shRNA)干扰并下调RRM2的表达后，真核生物胞质伴侣素ζ-1(CCTζ-1)和Polo-样激酶1(PLK1)的表达水平也出现降低，提示Plk1，CCTζ-1可能是RRM2的下游蛋白;免疫共沉淀提示CCTζ-1可以与RRM2抗体共沉淀。同时，课题组观察到抑制PLK1的表达可以降低细胞的增殖能力，并诱导凋亡。下调而CCTζ-1不能诱导凋亡。
　　 (6)干扰并下调PLK1的表达可以降低结肠直肠癌细胞的侵袭能力，而仅沉默CCTζ-1则不能降低结肠直肠癌细胞的侵袭能力。
　　结论：
　　 RRM2在结肠直肠癌组织中呈过表达，影响人结肠直肠癌细胞的肿瘤生物学行为;且对结肠直肠癌进展和预后具有一定作用，Plk1，CCTζ-1可能是RRM2的下游蛋白，其有望成为评估结肠直肠癌进展及预后的一个重要指标。

著录项

作者
陆爱国;
展开▼
作者单位

上海交通大学;

展开▼
授予单位上海交通大学;
学科外科学
授予学位博士
导师姓名郑民华;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类手术（外科）疗法;
关键词
核糖核苷酸还原酶M2亚基; 结肠直肠癌; 紫外线; DNA损伤; 修复机制; 侵袭能力;
入库时间 2022-08-17 11:14:59

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