低温冷冻过程中胞内冰晶生长机制与应用研究

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低温造成的直接细胞损伤，与组织冷冻及复温过程中形成的胞内冰晶有密切关系。理解胞内冰晶形成与生长机制，对于肿瘤低温手术以及重要细胞和组织的成功保存有着重要的意义。然而，由于胞内冰晶形成和生长的速率太快，传统成像手段无法捕捉到这一瞬间过程以及胞内冰晶的生长细节，这阻碍了人们对于胞内冰晶形成机理的认识。因此，本论文在传统低温显微技术中引入了高速 CMOS成像系统，结合优化的成像条件和图像处理方法，首次成功地观察到了在贴壁人乳腺癌细胞系（MCF-7）和人脐静脉内皮细胞系（HUVEC）细胞内的冰晶形成和生长的清晰结构，并深入比较了在有接种和无接种冰晶条件下，胞内冰晶生长和重结晶现象的不同特点。研究发现，在有接种冰晶条件下，无论是内皮细胞还是乳腺癌细胞,其胞内冰晶总是在较靠近细胞核的细胞膜上成核。随后，冰晶向细胞核方向生长，在覆盖整个核内空间后再次进入细胞质。细胞核内冰晶生长速率要远远大于细胞质中。胞内冰晶的形态受降温速率的影响较大，且在复温过程中没有出现重结晶现象。而在没有接种冰晶条件下，胞内冰晶出现的温度范围要小得多，且枝状形态不易辨认，受降温速率影响很小，在复温过程中可观察到重结晶现象。此外，胞内冰晶生长速率更快，并且覆盖了整个胞内空间，而不是像在有接种冰晶条件下，冰晶停止生长在靠近细胞核周围的细胞质中。这些研究结果表明细胞核在胞内冰晶的形成与生长过程中有着重要的作用，这对于理解冰晶形成的机理有着重要的意义。研究结果还成功解释了低温手术中肿瘤周边区域杀伤效果不佳的根本原因，同时也为进一步优化肿瘤低温手术提供了新的方向。
　　由于胞内冰晶形成受到很多因素的影响，通常采用形成概率来预测其出现的可能性。然而已有的不论是基于现象还是基于机理的预测模型，受限于细胞类型、保护剂或者温度范围等，不能准确地估算不同细胞类型内的胞内冰晶形成概率。为了更准确地预测胞内冰晶形成概率，我们建立了描述胞内冰晶有限扩散和生长的新模型。在该模型中，我们同时考虑了同相成核和异向成核机理。冻存保护剂的粘滞系数和扩散系数则用自由体积模型进行估算。在与文献实验结果对比验证后，该模型被用来计算不同细胞类型的冷冻保存临界降温速率和保护剂浓度。对于低速降温保存，我们发现临界降温速率是和细胞类型相关的，但受细胞大小和水分输送参数影响较大。而对于玻璃化保存，细胞类型的影响要大于细胞大小，特别是受与冰晶成核相关的热力学和动力学参数影响非常明显。该模型进而被应用于鹿鼠卵母细胞冷冻过程中的水分输送和胞内冰晶形成现象研究。从估算所得可知，鹿鼠卵母细胞具有很高的水分输送活化能，因此对降温速率的变化非常敏感。同样，接种冰晶对于胞内冰晶的形成有很大影响。没有接种冰晶条件下的胞内冰晶形成动力学参数与温度变化密切相关。这些发现对于优化卵母细胞玻璃化冷冻保存策略有着重要意义。

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作者
杨戈尔;
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作者单位

上海交通大学;

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授予单位上海交通大学;
学科生物医学工程
授予学位博士
导师姓名徐学敏;
年度 2011
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类低温生物医学;
关键词
低温手术; 胞内冰晶; 冷冻保存; 成核机理; 细胞类型;

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