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DNA指纹图谱技术和克隆文库分析方法在微生态制剂质量检测中的应用

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微生态制剂又叫微生态调节剂，是由调节肠道微生态失调、保持微生态平衡、提高宿主(人或动物)健康水平或增进健康状况的益生菌极其代谢产物和促进物质组成的制剂。此外，在农业中广泛使用的微生物肥料也属于微生态制剂。目前国内对微生态制剂质量检测主要依靠传统的分离培养和显微镜观察技术。本研究以微生物肥料和酸奶为研究对象，尝试用DNA指纹图谱技术和克隆文库分析方法来对微生态制剂的微生物组成进行检测，以期建立一种新的、快速的微生态制剂质量监测检验新方法。本论文主要包括以下两个方面: １、用DNA指纹图谱技术结合克隆文库分析方法对微生物肥料质量进行监测 微生物肥料中的微生物组成及其稳定性是评价微生物肥料质量的重要指标之一。由于传统的分离培养技术无法对微生物肥料的菌种组成及其稳定性做出全面客观的评价，本研究尝试用分子生态学方法结合分离培养技术解决这一问题。本文应用PCR-DGGE技术对某微生物肥料的质量稳定性进行了跟踪监测，并结合分离培养和克隆文库分析方法对其菌种组成进行了检测。结果表明，供试样品同一个生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌DGGE图谱相似性为80％~100％，3个不同生产批次之间DGGE图谱相似性为80％~88％，表明该微生物肥料的菌种组成的稳定性较好。但分离培养和克隆文库分析结果显示样品的菌种组成与产品标签说明之间存在较大差异。对于产品标注的6种微生物组成，用分离培养方法和克隆文库均只能检测到其中的Lactobacillus。分离培养方法和克隆文库分析都检测到了Lactobacillus、Bacillus和Monascus三个属的部分种，克隆文库分析还检测到了Brevibacillus、Psudononas 和 Penicillium属的部分种，其中Lactobacillus属在文库中所占比例最高，达到77.8％。而这些微生物并未包括在产品说明中，这说明产品生产过程中可能存在一定的污染。本研究表明分离培养技术和分子生态学方法相结合，可以比较客观准确的对微生物肥料质量进行评估和监测。 2、用DNA指纹图谱技术对酸奶质量进行检测 酸奶是一种消费者喜爱的微生物保健品，国内对酸奶质量的检测目前主要依靠分离培养技术，由于分离培养方法诸多方面的不足，给酸奶质量的检测和跟踪监测增加了困难。本研究尝试用分子生态学方法对酸奶质量进行评估，以期建立一种快速准确的酸奶质量跟踪监测检验的新方法。本节用PCR-DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis,变性梯度凝胶电泳）指纹图谱技术对市售某品牌酸奶在一个月内进行了动态监测，首先收集了6个生产批次的18个酸奶样品，建立了DNA提取、DGGE分析、DGGE图谱条带割胶回收测序等一套完整的检测评价方法，通过比较不同样品DGGE图谱以及对DGGE条带的割胶回收测序等对样品微生物组成及其稳定性进行跟踪监测。测序结果显示，供试样品微生物组成与厂家标注完全一致，且没有检测到杂菌污染。同时，根据样品DGGE指纹图谱分析结果，在整个动态监测期内样品微生物组成比较稳定。此外，本章内容还包括了另外3个生产批次的9个酸奶样品的研究，主要采用ERIC(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus, 肠杆菌基因间保守重复序列)-PCR和PCR-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis,变性梯度凝胶电泳)指纹图谱技术对其菌种组成及其稳定性进行评价。ERIC-PCR指纹图谱聚类分析结果显示，同一生产批次内3个不同包装的样品ERIC-PCR指纹图谱相似性为90％左右，而不同生产批次样品之间ERIC-PCR指纹图谱相似有所下降，为82％。该结果进一步用DGGE指纹图谱得到证实。DGGE分析结果表明，G2样品明显缺少一条主带，经割胶回收测序发现这条主带代表的微生物是Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus，说明该产品不同生产批次间的稳定性不是很好。DGGE图谱和测序结果还显示，除G2样品外，该酸奶样品的菌种组成与产品标签说明是一致的。本研究用菌种组成及其稳定性两个指标对酸奶样品质量进行评价，建立了PCR指纹图谱评价方法，结果表明，该技术可以作为酸奶质量控制和动态监测的快速简便的新方法。 总之，相信DNA指纹图谱技术和克隆文库分析方法可以作为一种微生态制剂质量的快速检测方法。

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