胶原酶浓度及消化时间对大鼠胰岛细胞分离的影响

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糖尿病是一种危害人类健康的重要疾病。胰岛移植是新近发展起来的一种具有显著优势的替代胰腺内分泌功能的技术。由于胰岛在分离纯化后所得的细胞数量过少，使这项技术始终未得到广泛应用，因此提高胰岛分离纯化效果，获取足够数量和高质量胰岛细胞成为胰岛移植技术成败的关键。目前动物实验中普遍应用胶原酶V进行胰岛细胞的分离，本文根据传统的组织切碎消化技术及改良型静止消化技术对大鼠胰岛细胞分离技术进行探讨，针对不同浓度和同一浓度条件下不同时间点胶原酶分离所获得胰岛细胞的效果进行分析比较，为胰岛细胞分离技术中最关键的胶原酶使用方案提供一个可行的标准化方案。方法：将32只SD大鼠分为两部分。第一部分为时间实验，取16只大鼠分4组(T1、2、3、4)，每组4只，采用0.5g/L、1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L四种浓度的胶原酶对胰腺进行消化，消化过程中每隔10分钟取定量细胞悬液行DTZ染色观察，确定各浓度最佳消化时间点。第二部分为浓度实验，另16只大鼠以同样方法分4组(C1、2、3、4)，每组4只，按已确定的时间点消化，分离后采用间断密度梯度离心法纯化胰岛，DTZ染色计数，AO-PI荧光染色分析存活率，确定胶原酶最佳浓度。将18只昆明小鼠分为A、B、C 3组，A、B组腹腔注射STZ建立糖尿病模型，对B组成模小鼠进行肾被膜下胰岛细胞移植，尾静脉采血监测记录各组小鼠血糖变化值。C组为对照组。结果：各浓度组最佳消化时间：T1组50分钟，T2组40分钟，T3组和T4组为30分钟。不同浓度条件下分离纯化后胰岛细胞数量为：C1组180.00±73.48个，C2组473.00±97.74个，C3组552.75±69.25个，C4组416.50±138.95个。分离纯化后回收率比较，C1获取细胞量最少(P<0.01)。荧光染色分析存活率比较，C4组活力最低(P<0.01)。12只小鼠中有7只(58.3％)成模。对B组4只成模小鼠进行胰岛细胞移植后3只(75％)血糖次日内恢复正常。未使用免疫抑制药物的情况下，1只小鼠移植后维持正常血糖达21天。结论：在胰腺灌注良好情况下，胶原酶控制在浓度1.5g/L，时间30分钟进行水浴振荡(20次/分)可获得良好的分离效果。 STZ药物致小鼠糖尿病模型建模可行性得到验证，糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植后血糖明显改善。

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作者
范宇;
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作者单位

解放军总医院;

解放军医学院;

军医进修学院;

中国人民解放军军医进修学院;

中国人民解放军总医院;

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授予单位解放军总医院;解放军医学院;军医进修学院;中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院;
学科外科学(泌尿外)
授予学位硕士
导师姓名钱叶勇;
年度 2007
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类糖尿病;
关键词
胰岛细胞; 分离纯化; 胶原酶; 糖尿病; 胰岛移植;

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