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西藏自治区结核分枝杆菌临床分离菌株的基因分型初步研究

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论文说明：缩略词表

声明

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

(一)技术路线

(二)结核分枝杆菌的鉴定

(三)结核分枝杆菌耐药性检测

(四)IS6100限制性片段长度多态性(IS6100-RFLP)分型方法

(五）Spoligotyping分型方法

(六)多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)

(七)三种分型结果的数据处理与统计学分析

结果

一西藏地区216株结核分枝杆菌临床分离株的来源

二216株临床分离株的菌型鉴定结果

三216株结核分枝杆菌临床分离株的药敏鉴定结果

四应用三种基因分型方法对216株西藏临床分离的结核分枝杆菌进行分析

(一)Is6110限制性片段长度多态性分析

(二)间隔区寡核苷酸分型

(三)多位点数目可变串联重复序列分析

(四)用HGI对三种方法进行评价

(五)IS6110-RFLP、 Spoligotyping和mlva的特异性比较

(六)西藏地区结核分枝杆菌基因型的特点

讨论

结论

参考文献

附录

综述结核分枝杆菌株水平鉴定和基因分型技术研究进展

致谢

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摘要

为了解西藏地区结核分枝杆菌的基因型分布等分子流行病学特点，本研究选取西藏六个地区作为调查点，采用统一调查表，于2005年1月～2006年1月，对结核病防治所的门诊结核病人进行调查，收集相关临床资料，取痰标本，用改良罗氏培养基常规分离培养病原，采用生化反应方法进行菌种鉴定，用绝对浓度法进行药物敏感性试验。其后分别采用IS6110-RFL，P、MLVA和Spligotyping方法进行基因分型。 经鉴定，本研究所用的216株临床分离株全部为结核分枝杆菌。药敏试验结果显示，完全敏感株(对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素敏感)74株，占34.25％，耐药株142株，占65.74％，其中单耐药24株，占11.11％，耐多药和两种以上多耐药118株，占54.63％，初始耐药43例，占30.28％，继发耐药99例，占69.72％。采用IS6110-RFLP分型，依据菌株间相似系数大小，216株结核分枝杆菌菌株可分为14基因群(Gene group)214种基因型，分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M和N基因群。A群包含4株，占1.85％，分为4种基因型；B群1株，占0.46％，分为1种基因型；C群161株，占74.07％，分为160种基因型，其中1种基因型含有2株，成为1簇；D群22株，占10.19％，分为22种基因型；E群8株，占3.7％，分为8种基因型；F群6株，占2.78％，分为6种基因型；J群5株，占2.31％，分为5种基因型；M群3株，占1.4％，分为2种基因型，其中1种基因型含有2株，成为1簇；G、H、I、K、L和N群均含1株，占0.46％，即各含1种基因型。 本研究中西藏地区216株结核分枝杆菌临床分离菌株中，IS6110的指纹带数目范围1-19条，其中RLFP指纹拷贝数最多的为11条和12条，各占检测菌株的19.9％(43/216)，其次为10条和13条，占14.4％(31/216)；其它依次为9条，占8.3％(18/21.6)；14条，占5.6％(12/21.6)；15条，占5.1％(11/216)：16条，占3.7％(8/216)；17条，占1.9％(4/216)；6条，占1.4％(3/216)；8条，占1.4％(3/216)；19条，占1.4％(3/216)，5条，占0.9％(2/216)，2条，占0.9％(2/216)；7条，占0.5％(1/216)，1条，占0.5％(1/216)。未发现0拷贝。 采用Spoligotyping分型，216株结核分枝杆菌可分为5个基因群24种基因型，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ基因群。Ⅰ群包含16株，占7.41％(16/216)，分为9种基因型，其中4种基因型含有11株菌，成为4簇，分别含有2、2、4和3株菌；Ⅱ群3株，占1.38％(3/216)，分为3种基因型；Ⅲ群176株，占81.48％(176/216)，分为7种基因型，其中1种基因型含有170株，成为1簇；Ⅳ群19株，占8.80％(19/216)，分为4种基因型，其中2种基因型含有17株，成为2簇，分别含有15和2株菌；V群2株，占0.9％(2/216)，分为1种基因型，成为1簇。最大的1个基因群含有176株菌，其特点为具有相同的Spoligotyping结果，表现为1～34间隔区杂交呈阴性反应，为北京家族(Beijijng Family)。其中，170株菌，在35～43之间的9个间隔区呈阳性杂交，被鉴定为典型的北京家族(Typical Beijing family)，6株表现为仅与35～43之间的8个间隔区杂交，与典型的北京家族仅相差1个间隔区，称为北京样基因型(Beijing-like)，即非典型北京家族(Atypical Beijing family)。北京家族菌株中，有卡介苗接种史者占43.75％(77/176)，无卡介苗接种史者占56.25％(99/176)，两者间的差异无统计学意义(x<'2>=1.007，P=0.316，P>0.05)，即患者卡介茁的接种与结核分枝杆菌北京家族基因型间无相关性。北京家族菌株中，敏感菌株占34.09％(60/176)，耐药菌株占65.91％(116/176)，非北京家族菌株中，敏感菌株占35％(14/40)，耐药菌株占65％(26/40)，两者间的差异无统计学意义(x<'2>=19.209，P=0.084，P>0.05)，即耐药性与结核分枝杆菌北京家族基因型间无相关性。北京家族的菌株与非北京家族菌株在各年龄段分布上的差异无统计学意义(x<'2>=22.296，P=0.513，P>0.05)。北京家族菌株中，男性患者占54.54％(96/176)，女性患者占45.45％(80/176)，两者间的差异无统计学意义(x<'2>=0.815，P=0.815，P>0.05)。北京家族菌株在西藏六个地区分布上的差异也无统计学意义(x<'2>=0.686，P=0.686，P>0.05)。 采用MLVA分型，216株结核分枝杆菌临床分离株可分为19个基因群108种基因型，分别为a、b、C、d、e、f、g、h、i、i、k、l、m、n、o、P、q、r和s基因群。其中a群包含2株，占0.9％(2/216)，分为2种基因型；b群2株，占0.9％(2/216)，分为2种基因型；e群4株，占1.8％(4/216)，分为4种基因型；i群2株，占0.9％(2/216)，分为1种基因型，成为1簇；i群187株，占86.57％(187/216)，分为80种基因型，其中25种基因型含有132株菌，成为25簇，分别含有3、9、2、4、3、2、2、5、2、2、4、15、14、4、5、12、21、2、2、2、3、6、2、4和2株菌；l群2株，占0.9％(2/216)，分为2种基因型；n群3株，占1.3％(3/216)，分为3种基因型；o群3株，占1.3％(3/216)，分为2种基因型，其中1种基因型含有2株菌，成为1簇；c、d、f、g、h、k、m、p、q、r、s均为1株，各占0.45％(1/216)，各为1种基因型。在20个VNTR位点中，Mtub21、ETR.E位点的多态性较高，MIRU26、Mtub30、ETR-A、MIRU10、MIRU23、MIRU16、Mtub02、MIRU39、MIRU40位点呈中等程度的多态性，而其他7个位点的多态性较差，其中Mtub02位点可鉴别北京家族和非北京家族，它鉴别的北京家族与Spoligotyping鉴别的北京家族符合率达到100％。 用HGI对三种方法进行评价，就基因分型达菌株株水平鉴定而言，MLVA的分辨能力与IS6110-RFLP接近，其分辨指数分别为97.5％和99.99％。而以Spoligotyping的分辨能力最差，分辨指数为37.63％。 本研究分别采用IS6110-RFLP、Spoligotyping和MLVA技术对216株结核分枝杆菌临床分离株进行了基因分型分析。结果显示，采用IS6110-RFLP技术可以将216株菌分成214种基因型，其中212种基因型只有1株菌，占98.14％(212/216)。另有4株菌有两种基因型，占1.85％(4/216)，且这4株菌中有2株菌为IS6110单拷贝菌株。这说明该方法对“于仅有单拷贝IS6110的菌株难以进行株水平的鉴定。采用Spoligotyping分型方法可以将216株菌分成24种基因型，其中16种基因型只有1株菌，对2株IS6110单拷贝的菌株可以分为1个基因型。而采用MINA分型方法可以将216株菌分成108种基因型，各型的VNTR指纹图谱不同，表现出明显的基因多态性。其中80种基因型只有1株菌，占37.03％(80/216)。另有136株菌表现出28种基因型，占62.96％(136/216)。而且MLVA方法将2株IS6110单拷贝菌株分为2个基因型。研究结果显示Spoligotyping方法在对结核分枝杆菌进行株水平的鉴定时，其辨别能力低于IS6110-RFLP和MLVA。对于IS6110单拷贝或低拷贝的菌株，MLVA和Spoligotyping辨别能力要比IS6110-RFLP好。但是如果将三种方法结合起来，对结核分枝杆菌进行株水平鉴定的能力明显高于三种方法单独使用，从株水平上鉴别216株结核分枝杆菌，可以分成214种基因型，只有两株菌没有鉴别开来。此外，Spoligotyping方法还可以鉴定“北京家族”菌株。综上所述，IS6110-RFLP分型分辨力高，为推荐的标准方法，但需菌量大(约2μg，操作较复杂，对IS6110拷贝数少的菌株分辨能力较差。Spoligotyping是一种以：PCR为基础的方法，它操作简单、快速、需菌量小，可以直接用于临床标本的检测，且结果易于判定，尤其是对IS6110拷贝数少的菌株，分辨力较高，被认为是进一步检测和鉴定结核分枝杆菌复合群，特别对于北京家族的鉴别是一种非常有价值的方法。MLVA技术的分辨力与：IS6110-RFLP接近，且优于IS6110-RFLP的方面在于它是PCR为基础的方法，操作简便，快速(获得结果只需一天)，结果便于实验室直接进行比较研究。 本研究初步证实，西藏地区存在主要流行型----北京家族，占全部菌株的81.48％(176/216)。北京家族与卡介苗接种、耐药性的无明显相关性。

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