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黑色素瘤基因表达谱和Caspase家族、IAP家族、Bcl-2家族及Cytokeratin家族分子改变的研究

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摘要

第一部分利用全基因组寡核苷酸基因芯片研究恶性黑色素瘤细胞与黑色素细胞基因表达谱

第二部分恶性黑色素瘤细胞和组织与良性黑色素细胞增生病变组织中凋亡相关Caspase家族、IAP家族、Bcl-2家族分子改变的系统验证

第三部分对恶性黑色素瘤细胞和组织中细胞角蛋白家族表达状况的系统验证

第四部分利用反义寡核苷酸技术干扰恶黑细胞中Bfl-1和Bcl-xI的表达，增加恶黑细胞对UV诱导的凋亡的敏感性

REFERENCES

[综述]恶性黑色素细胞瘤抗凋亡的分子机制

致 谢

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摘要

背景和目的：恶性黑色素瘤(MM)转移早、死亡率高，对诱导细胞凋亡的各种治疗手段高度耐受，提示MM：中存在严重的凋亡调控紊乱。然而，MM复杂的抗凋亡机理尚未阐明，也缺乏MM中凋亡调控基因总体表达的系统研究。利用基因芯片技术能够从整个基因组水平上对疾病的基因谱进行系统检测。本研究试图(1)通过全基因组基因芯片检测从整体角度了解MM细胞和黑色素细胞全基因组表达谱，特别是凋亡相关基因的表达谱差异；(2)根据基因芯片结果，对caspaSe家族、IAP家族、Bcl-2家族和cytokeratin家族分子在MM细胞株、MM组织和黑色素细胞痣组织中的表达进行RNA和蛋白质水平的验证，以进一步确定其表达水平及与MM临床病理指标及预后间的关系。(3)针对筛选出的有意义分子进行靶向干预，了解干预后细胞凋亡相关分子的变化及对凋亡诱导因子敏感性的改变，为临床应用打下基础。 材料与方法：(1)制备黑色素瘤细胞(A375，A875，M14)和正常人黑色素细胞HEMn-LP的cDNA，体外转录为cRNA，与含有54614个探针／47000转录本／38500个人类基因的Human Genome U1 33 Plus 2.0 Array寡核苷酸芯片(Affymetrix，USA)杂交，获得黑色素瘤细胞株和正常黑色素细胞的全基因差异表达谱，通过生物信息学和功能基因组学分析，获得显著差异表达的候选基因。(2)采用RT-PCR、实时荧光定量PCR、原位杂交、免疫组织化学、Western blot等方法对MM组织和良性黑色素细胞增生性病变组织中caspase家族、IAP家族分子、Bcl-2家族和cytokeratin家族分子改变进行系统验证，并分析各分子表达水平与相应临床病理指标和预后的关系。(3)采用反义寡核苷酸技术干预高表达的分子，检测干预后细胞凋亡相关分子表达水平和死亡率的变化以及对凋亡诱导因子敏感性的改变。 结果：全基因组基因芯片结果显示：(1)与正常黑色素细胞相比，38500个基因中三个MM细胞株相对表达水平同时升高2倍以上的基因共1236个，下降2倍以上的基因1309个，分属不同的通路。(2)表达上调的基因中31个属于凋亡相关通路和细胞周期调控基因；表达下降的基因中有12个属于以上两条通路。凋亡抑制基因c-IAPl、Survivin和Mcl-1等在MM中表达显著升高，促凋亡基因Bad和HRK表达下降；相反，凋亡抑制基因Bcl-2表达下降，凋亡效应基因caspase-8和Bid表达上调。(3)MM细胞中黑色素细胞分化相关基因tyrosinase和Mart-l／Melan-A表达下调，黑色素瘤相关抗原(MAGE)家族成员多数表达上调。(4)MM细胞中代谢调控紊乱，糖、脂、蛋白质、核酸代谢增强。DNA复制和RNA合成相关基因表达上调。(5)MM细胞中MAPK通路、P13K／AKT通路和WNT通路活化；细胞周期素蛋白家族促增殖基因表达上调。(6)TGF-β信号途径大量基因表达下降。(7)MM细胞中细胞角蛋白家族CK 6、7、18表达明显增加。 系统验证结果表明：(1)相对于黑色素细胞痣，MM细胞和组织在RNA水平上高表达抗凋亡分子c-IAP 1，c-IAP2，Survivin，Bcl-xl，Bfl-1和促凋亡分子caspase-8和Bnip3。(2)相对于黑色素细胞痣，MM细胞和组织在蛋白水平上高表达抗凋亡分子c-IAPl，c-LAP2，Survivin，Livin和Bcl-x1。(3)MM中抗凋亡蛋白的整体表达水平较高，促凋亡蛋白caspase 6、7、8、10的水平较低，但是凋亡效应蛋白caspase-3的表达上调。(4)皮肤原发MM、粘膜原发MM与转移性MM之间，促凋亡和抗凋亡蛋白表达均无明显差别。(5)MM细胞中存在多种细胞角蛋白(包括CK 6、7、8、14、18等)。CKl8在转移性MM中的表达明显高于皮肤原发和粘膜原发MM。(6)生存分析显示：本组MM病例中，继发组、AJCC分期高于Ⅲ期组，伴有淋巴结转移／远处转移组预后较差；胞浆survivin的表达与MM的预后呈负相关。 用Bfl-1反义寡核苷酸转染MM细胞Sk-Mel-1，阻断Bcl-xl和：Bfl-1表达后，导致线粒体外膜通透性增加，Sk-Mel-1细胞对UV诱导的凋亡的敏感性增强，生长受到抑制，其效果与干预Bcl-x1表达的效果一致。 结论：(1)MM细胞中IAP家族和Bcl-2家族抗凋亡蛋白高表达及部分促凋亡蛋白表达水平低下，可能在MM抗凋亡机制中起重要作用。Survivin的表达与恶黑病人预后相关。(2)MM细胞中MAPK通路和P13K／AKT通路的许多基因表达上调。(3)MM细胞中存在多种细胞角蛋白(包括CK 6、7、8、l4、18等)，转移性MM的CKl8表达增加。(4)阻断Bfl-1和Bcl-x1表达，导致MM细胞的线粒体外膜通透性增加，对UV诱导的凋亡的敏感性增强，提示Bfl-1与Bcl-xl均通过凋亡的线粒体途径调节细胞死亡。Bfl-1可能成为治疗MM的新靶点。

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