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普陀山苔草(Carex putuoshanensis sp.)和金叶苔草(Carex evergold)铅锌富集及谷胱甘肽表达研究

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摘要

前言

1.1重金属污染土壤的生态修复方法

1.2重金属污染土壤的植物修复

1.2.1超富集植物

1.2.2苔草

1.2.3植物对重金属胁迫的响应机制

1.3还原型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽合成酶

1.3.1谷胱甘肽的合成与调控

1.3.2谷胱甘肽对重金属胁迫的响应

1.3.3谷胱甘肽的合成酶基因与植物重金属耐性

1.3.4 GCS基因的克隆及表达研究

1.4研究目的及意义

2材料与方法

2.1.4引物

2.2方法

2.2.1苔草的处理与培养

2.2.2苔草生长指标、铅锌含量及GSH含量的测定

2.2.3苔草GCS基因的克隆

2.2.4普陀山苔草和金叶苔草GCS基因序列分析

2.2.5铅锌胁迫下苔草GCS基因的组织特异性表达

2.3数据处理与分析

3结果与分析

3.1苔草铅锌胁迫下的生长响应

3.1.1普陀山苔草铅锌胁迫下的生长响应

3.1.2金叶苔草的生长响应

3.1.3两种苔草铅锌胁迫下的生长响应

3.2苔草铅锌胁迫下的铅富集特征

3.2.1普陀山苔草铅锌胁迫下的铅富集特征

3.2.2金叶苔草的铅富集特征

3.2.3两种苔草铅锌胁迫下的铅富集特征

3.3苔草铅锌胁迫下的锌富集特征

3.3.1普陀山苔草的锌富集特征

3.3.2金叶苔草的锌富集特征

3.3.3两种苔草铅锌胁迫下的锌富集特征

3.4苔草铅锌胁迫下的GSH含量

3.4.2金叶苔草的GSH含量

3.4.3两种苔草铅锌胁迫下的GSH含量

3.5苔草GCS基因的克隆与分析

3.5.1普陀山苔草和金叶苔草总RNA提取及检测

3.5.2普陀山苔草GCS基因(CpGCS)的克隆与分析

3.5.3金叶苔草GCS基因(CeGCS)的克隆与分析

3.6苔草铅锌胁迫下GCS基因的相对表达量

3.6.1 qRT-PCR体系建立

3.6.2 CpGCS基因的表达量

3.6.3 CeGCS的相对表达量

3.6.4两种苔草铅锌胁迫下的GCS基因的表达量

3.7苔草GSH的表达的分析

3.7.1普陀山苔草GSH的分析

3.7.2金叶苔草GSH的分析

4讨论

4.1苔草铅锌胁迫下的生长响应

4.2苔草铅锌胁迫下的铅锌含量

4.3苔草铅锌胁迫下的GSH含量

4.4苔草铅锌胁迫下GCS基因的表达

4.5苔草铅锌胁迫下GSH的表达

5结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

作者简历

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摘要

本文在课题组前期试验的基础上,以铅超富集植物普陀山苔草(Carex putuoshanensis sp.)和铅富集植物金叶苔草(Carex evergold)为研究对象,按照课题组前期研究的最佳铅锌处理浓度,以空白为对照,通过铅(Pb)(600mg/L)、锌(Zn)(125mg/L)单一和铅锌(Pb+Zn)复合(Pb600mg/L、Zn125mg/L)三个胁迫,对两种苔草在幼苗期、开花期和立枯期的生长响应,Pb、Zn富集及谷胱甘肽(glutathion,GSH)含量和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)表达进行研究,探讨两种苔草在三个生长期铅锌胁迫下的Pb、Zn富集特征和GSH的表达,进一步揭示GSH表达在两种苔草铅锌富集过程中的作用,为植物修复的应用及植物对重金属耐性机制的研究提供参考。研究结果如下:
  (1)Pb、Zn、Pb+Zn胁迫下,与对照相比,开花期是普陀山苔草和金叶苔草对Pb、Zn胁迫响应最敏感的时期;开花期的Pb、Zn、Pb+Zn各胁迫间,普陀山苔草Pb+Zn胁迫下Pb含量大于Pb胁迫下的Pb含量,而金叶苔草则相反,因此,一定浓度的Zn促进了普陀山苔草对Pb的吸收,而抑制了金叶苔草对Pb的吸收;普陀山苔草的Pb含量大于金叶苔草。
  (2)Pb、Zn、Pb+Zn胁迫促进了普陀山苔草和金叶苔草不同生长期GSH的合成,在开花期,两种苔草GSH含量最大。开花期的Pb、Zn、Pb+Zn各胁迫间,普陀山苔草在Pb+Zn复合胁迫下,地上部和地下部GSH含量分别比Pb、Zn单一胁迫增加了33.45%、24.80%和76.81%、9.78%,Pb+Zn复合胁迫对普陀山苔草GSH的合成表现为协同作用;而金叶苔草地上部和地下部GSH含量分别比Pb、Zn单一胁迫减少了40.07%、18.37%和14.79%,Pb+Zn复合胁迫对金叶苔草GSH的合成具有抑制作用。
  (3)普陀山苔草和金叶苔草GSH合成酶GCS基因及编码的蛋白结构分析发现,普陀山苔草GCS基因(CpGCS)和金叶苔草GCS基因(CeGCS)分别含有1314bp和1392bp个碱基组成的开放阅读框,分别编码437个和463个氨基酸,其分子量分别为50.99和53.11KDa,均属于亲水性蛋白,亚细胞定位预测CpGCS和CeGCS基因编码的蛋白主要位于细胞核和线粒体。CpGCS基因和CeGCS基因的氨基酸序列与百日菊、水稻、玉米的相似性分别为88%,83%、87%,85%、88%,90%。该基因的氨基酸序列中包含谷氨酸-半胱氨酸连接酶和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的结构域,该结构域是两种苔草响应Pb、Zn胁迫的关键。通过对Pb、Zn、Pb+Zn胁迫下两种苔草在不同生长期植物组织中GCS基因表达分析发现,两种苔草地上部和地下部GCS均上调表达,在开花期GCS基因表达量最大;开花期的Pb、Zn、Pb+Zn各胁迫间,普陀山苔草CpGCS地上部和地下部表达量在Pb+Zn胁迫下最大。同时CpGCS表达量大于CeGCS表达量,这说明CpGCS蛋白催化合成的GSH,其结合Pb的量高于CeGCS蛋白催化合成的GSH,这也是普陀山苔草的一个特性。
  (4)Pb、Zn和Pb+Zn胁迫下,GSH的表达对普陀山苔草和金叶苔草Pb的吸收和转运具有显著正相关作用。

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