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鲜切生菜中沙门氏菌的生长预测及渗透抗逆境应答基因rpoS对沙门氏菌的影响

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摘要

1．文献综述

1．1 立题背景

1．1．1 预测微生物学

1．1．2 水分活度

1．1．3 sigma因子

1．2 研究目标

1．3 研究内容

1．4 技术路线

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 样品、菌株及质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 试剂

2．1．4 引物

2．2 仪器设备

2．3 方法

2．3．1 周期性高渗透压刺激下沙门氏菌SL1344的生长测定

2．3．2 沙门氏菌rpoS缺失菌株SL1344／ΔrpoS的构建

2．3．3 沙门氏菌野生菌株LQG-1的筛选及鉴定

2．3．4 不同环境下沙门氏菌SL1344、SL1344／ΔrpoS、LQG-1的生长测定

3 结果与分析

3．1 周期性高渗透压刺激下沙门氏菌SL1344的生长测定

3．1．1 SL1344的驯化结果

3．1．2 渗透压条件的确定

3．1．3 生长数据的采集

3．2 沙门氏菌rpoS缺失菌株SL1344／ΔrpoS的构建

3．2．1 目的基因rpoS的鉴定

3．2．2 含rpoS同源臂的CmLr基因片段的扩增

3．2．3 SL1344／Arpos：：CmLr菌株的鉴定

3．2．4 沙门氏菌rpoS基因缺陷菌株的PCR鉴定

3．3 沙门氏茵野生菌株LQG-1筛选鉴定结果

3．3．1 革兰氏染色结果

3．3．2 16SrDNA鉴定

3．3．3 系统进化树

3．4 不同环境下沙门氏菌SL1344、SL1344／ΔrpoS、LQG-1的生长比较

3．4．1 营养富集条件下三菌株的生长比较结果

3．4．2 高渗应激条件下SL1344与SL1344／ΔrpoS缺陷菌株的生长比较结果

3．4．3 实际食品(鲜切生菜)中三菌株的生长比较结果

4 讨论

5 全文结论

6 创新点与展望

6．1 创新点

6．2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的文章目录

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摘要

沙门氏菌是一种分布广泛的食源性致病菌，严重影响着人们的健康和国民经济的发展。为了控制其危害，本文选用已经全基因测序的模式菌株Salmonellaenterica serovar Typhimurium SL1344，及本研究构建的rpoS基因缺失的SL1344菌株SL1344/ΔrpoS，和分离自食品中的野生菌株LQG-1进行微生物应急生长调控的研究。
　　首先对SL1344进行驯化，使其能够在只有葡萄糖能够提供碳源的BMM培养基中稳定生长;并将已驯化的SL1344菌株进行周期性高渗刺激，探究沙门氏菌延滞期的变化情况;接着以SL1344为原始菌株，采用λred同源重组技术构建逆境应答相关基因rpoS基因缺失的沙门氏菌菌株SL1344/ΔrpoS。同时，以并从生鲜猪肉中分离得到沙门氏菌野生菌株LQG-1为研究对象，对其进行鉴定，并将SL1344、SL1344/ΔrpoS及LQG-1的生长在逆境中进行比较，探究rpoS在渗透应答中在转录层面的调控方式和变化，说明在鲜肉与鲜切生菜交叉感染沙门氏菌后，rpoS对生长动力学参数的影响作用。
　　为说明环境周期性变化对微生物适应力的影响，对SL1344进行研究。结果表明(1)经驯化的SL1344连续3～4次传代，当初始菌量相同时，其达到稳定期时菌量的数量级也相同，说明SL1344能够在只有葡萄糖提供碳源的BMM培养基中稳定生长;(2)已驯化好的菌株SL1344在NaCl浓度为3％、3.5％、4％和5％的BMM中培养，根据其延滞期初始下降幅度及生长周期长短的比较结果，确定适宜的NaCl的添加浓度为3.5％;(3)已驯化且未经渗透处理的SL1344在含3.5％NaCl、0％NaCl的BMM中周期性交替的培养，并观察其在BMM-NaCl中的生长情况，结果发现SL1344首次在BMM-NaCl中培养，即为第0次转移，其延滞期初始下降幅度最大，生长至稳定期所需时间最长。随着转移次数的增多，延滞期的初始下降幅度越来越小，到第4次转移时几乎为零。
　　为研究逆境应答基因rpoS对实际食品中沙门氏菌生长的影响情况，通过λred同源重组技术，构建SL1344/ΔrpoS;从实际食品生鲜猪肉中分离得到LQG-1，并对其进行鉴定。结果显示:(1)构建SL1344/ΔrpoS菌株过程中，用同一对引物鉴定，rpoS基因PCR扩增产物片段、替换后扩增片段及消除后扩增片段分别为1344bp、1432bp、500bp左右，证明rpoS基因缺失菌株SL1344/ΔrpoS构建成功;(2)对LQG-1进行鉴定，其菌体短杆状、无芽孢、革兰氏染色呈阴性，经16SrDNA序列进行分析，确定其为沙门氏菌。
　　为探索rpoS基因与实际食品中沙门氏菌生长的影响，将SL1344、SL1344/ΔrpoS和LQG-1分别接种于LB肉汤、含NaCl3.5％的BMM以及鲜切生菜上，以Baranyi建立得到其一级模型，拟合得到其生长动力学相关参数，比较延滞期和最大比生长速率，可以得知:(1) LB液体培养基中，三菌株生长基本同步;(2)在含3.5％NaCl的BMM中，SL1344比SL1344/ΔrpoS更容易适应新环境;(3)在生菜上，LQG-1来源于食品，更易在实际食品中建立新的循环，适应新环境。SL1344菌株有小幅度的生长，SL1344/ΔrpoS几乎不生长，在一段时间后逐渐衰亡。

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