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桃EST-SSR引物开发及其在部分蔷薇科物种中的通用性研究

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摘要

缩略词

1 文献综述

前言

1.1 分子标记技术与SSR

1.2 SSR引物开发方法

1.2.1 实验挖掘法

1.2.2 软件挖掘法

1.3 研究进展

1.3.1 桃SSR引物开发现状

1.3.2 蔷薇科EST序列研究进展

1.4 本研究目的、意义及创新点

1.4.1 本研究目的

1.4.2 本研究意义

1.5 技术路线

2 材料与方法

2.1 材料、试剂与设备

2.2.1 实验材料

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要设备与耗材

2.2 实验方法

2.2.1 DNA准备

2.2.2 ESTs数据获得与处理

2.2.3 EST-SSR位点查找与引物设计

2.2.4 二核苷酸EST-SSR引物的PCR验证

2.2.5 EST-SSR引物在蔷薇科植物中的通用性检验

2.2.6 聚类分析

3 结果与分析

3.1 EST-SSRs规模

3.1.1 ESTs规模

3.1.2 EST-SSRs规模

3.2 EST-SSRs类型与分布频率

3.2.1 基序长度(Motif size)

3.2.2 基序组成(Motif forms)

3.2.3 重复次数(Repeat numbers)

3.3 EST-SSR引物

3.3.1 引物设计

3.3.2 引物抽选

3.4 引物验证

3.4.1 DNA质量检测

3.4.2 等位基因与杂合度

3.4.3 重复次数区间比较

3.5 桃EST-SSR引物在蔷薇科的通用性分析

3.5.1 通用性矩阵与缺失分布

3.5.2 等位基因与杂合度

3.5.3 聚类分析

4 讨论与结论

4.1 EST-SSR类型和分布频率

4.2 SSR引物开发效率和扩增

4.3 通用性分析

4.4 聚类分析

4.5 重要结论

5 展望

6 本研究创新点

参考文献

硕士阶段发表论文

致谢

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摘要

桃是世界上重要的经济果树和园林树种,同时也是蔷薇科木本模式植物,研究桃的种质资源和遗传背景具有重大意义。在当前,SSR标记仍然是研究植物物种种质资源和遗传背景的重要手段之一。然而,桃的可用SSR引物数量稀少,蔷薇科其他物种的SSR引物数量更是寥寥无几。2013年,Verde等人基于桃的不同器官进行了转录组测序,汇总先前的研究后共提交到NCBI公共数据库有80797条无冗余ESTs序列,为桃EST-SSR引物的大规模开发提供了丰富的序列资源。本研究先利用MISA软件对来自NCBI数据库的80797条EST序列进行SSR位点挖掘,然后利用primer3模块批量设计SSR引物,最后,采用PCR技术在12个不同类型的桃品种上分组随机验证了100对二核苷酸重复引物,在30个常见蔷薇科物种上分组随机调查了48对桃EST-SSR引物的通用性。主要研究结论如下:
  (1)EST-SSR位点挖掘
  利用CD hit软件对80797条无冗余EST序列的冗余率进行复查,发现冗余率仍有12.3%。用MISA软件对剩余70360条EST序列进行SSR位点挖掘,发现有12519个SSR位点分布于10272条ESTs序列中,SSR位点出现频率为14.60%。SSR类型覆盖二核苷酸重复到六核苷酸重复的159种基序类型。其中,以单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复类型最多,分别占35.80%、36.43%和25.56%。此外,SSR基序重复次数越多,SSR位点分布频率越低。在基序长度相同的SSRs中,不同基序组成分布不均匀,并且对少数基序组成有偏好。
  (2)SSR引物设计
  利用primer3模块对12519条EST-SSR设计引物,得到4526对SSR引物,其中,常用的二核苷酸引物和三核苷酸引物合计有2598对。引物开发效率只取决于EST-SSR基数的大小,引物开发总效率为36.15%。
  (3)SSR-PCR验证
  分段抽选的100对SSR引物在12个不同类型的桃品种上扩增出237个条带,平均2.37个;79%的引物能够扩增出2个或2个以上的条带。期望杂合度变幅为0-0.7659,平均0.3817;观察杂合度变幅为0-0.9167,平均0.1230;引物鉴别力变幅为0-0.8056,平均0.4054。
  (4)通用性研究
  通用性分析表明:66.67%的SSR引物能够在30个蔷薇科物种上全部有效扩增,33.33%的SSR引物能够在30个蔷薇科物种中部分有效扩增。其中,引物018在16个物种上有缺失,是缺失率最高的引物;物种R30有7对引物没有扩增,是缺失程度最高的物种。95%以上的引物可以在66.67%以上的物种上得到有效扩增,90%以上的引物可以在93.33%的物种上得到有效扩增。

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