冷冻保护剂及抗氧化剂对猪冷冻精子中Caspase介导的细胞凋亡的影响

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人工授精技术已广泛应用于现代养猪生产，但冷冻精液使用率仅约1％。主要原因在于在冷冻保存过程中，精子结构和功能受到严重破坏，导致冷冻-复苏后精子活力严重下降，配种受胎率降低，窝产仔数减少。尽管在冷冻稀释液成分以及冷冻程序等方面做了大量工作，但效果仍不理想。研究表明冷冻参与精子中Caspase介导的细胞凋亡过程。然而，抗冻保护剂种类及浓度对细胞凋亡相关Caspases基因表达的影响尚不清楚。因此，本研究以添加不同冷冻保护剂、糖类、抗氧化剂的猪冷冻精子为实验材料，采用qRT-PCR、AnnexinⅤ-FITC等技术分析解冻猪精子的活率、活力;检测猪精子中Caspase基因在mRNA水平上的表达水平、Caspase蛋白酶活性以及冷冻-解冻后的猪精子膜上磷酯酰丝氨酸外翻(PS)的程度。结果如下:
　　(1) GeNorm结果表明，PGK1，ACTB和RPL4在所有样品中的表达稳定性高，NormFinder结果表明，GAPDH是最稳定的基因。此外，BestKeeper结果表明，三个最稳定的基因是PPIA，GAPDH和RPL4。用不同算法得到的参考基因的排名顺序有一些差异。总之，根据循环阈值变异系数(Ct CV％)和综合排名顺序确定GAPDH，RPL4和PPIA是冷冻猪精子中三个最稳定的基因。
　　(2)在LEY中添加6％EG、5％DMSO以及在LEY+3％甘油中添加0.035g/mL蔗糖、250mmol/L海藻糖、0.045g/mL乳糖、200 IU/mLCAT、4 mmol/L GSH、200IU/mLSOD在各自处理组中具有最高的精子活率、活力，但都显著低于LEY+3％甘油处理组（50.81±1.33％、43.22±2.99％）。
　　(3) qRT-PCR分析表明，除Caspase-1和-13外，Caspase-2、-6、-8和-15在3％甘油组中的表达水平显著低于对照组，表明3％甘油能有效抑制凋亡启动因子。EG不能有效抑制Caspase-1、-6、-13的表达，能抑制Caspase-2、-8及-15的表达，但抑制效果不及3％甘油。Caspase-1、-2、-6、-15在14％DMSO中的表达量显著低于3％甘油或与3％甘油无显著性差异。此外，Caspase-1、-8和-15在5％DMSO处理中的表达水平与3％甘油相比无显著性差异，表明DMSO是潜在的猪冷冻保护剂，而EG效果较差。0.035g/mL蔗糖能有效抑制Caspase-1和-15的表达，但不能有效抑制凋亡启动因子Caspase-2、-8及炎症介导因子Caspase-13的表达。0.015g/mL乳糖能有效抑制Caspase-2、-8、-13、-15的表达。400IU/mL CAT能有效抑制Caspase-1的表达，而300IU/mL CAT能有效抑制Caspase-2、-8和-13的表达。4mmol/L GSH及300 IU/mL SOD能有效抑制Caspases的表达。
　　(4)在EG、DMSO、蔗糖、海藻糖以及乳糖处理组中，Caspase-3蛋白酶活性水平都很低。除6％ EG外，各处理组中Caspase-3蛋白酶活性水平均显著低于直接冷冻组，但3％甘油组与对照组无显著差异。除2％EG和5％DMSO外，其余处理组中Caspase-6/9的活性水平均显著低于对照组，但与3％甘油无显著性差异。不同浓度蔗糖处理组中的Caspase-6/9的蛋白酶活性水平显著低于对照组和直接冷冻组;0.015g/mL和0.025g/mL蔗糖中Caspase-6/9的蛋白酶活性水平无显著差异，但均显著低于3％甘油。所有浓度的海藻糖、乳糖处理组中Caspase-6/9的蛋白酶活性水平均显著低于对照组与直接冷冻组，且在250 mmol/L海藻糖、0.035g/mL乳糖中Caspase-6/9的蛋白酶活性最低。在甘油、EG、DMSO、蔗糖及乳糖处理组中，各处理的Caspase-8的活性水平均分别显著低于对照组及直接冷冻组。在2％EG、5％DMSO及0.035g/mL乳糖中Caspase-8的活性最低，且分别显著低于3％甘油。此外，不同浓度的蔗糖均显著低于3％甘油，且在0.035g/mL时达到最低。而在海藻糖处理组中，除375 mmol/L海藻糖外，其余处理均显著高于对照组、直接冷冻组及3％甘油。
　　(5) EG和DMSO处理组中Annexin-Ⅴ+/PI+精子的百分比显著低于对照组、直接冷冻组及3％甘油，对照组与3％甘油间差异不显著，但都显著低于直接冷冻组。此外，0.015 g/mL和0.045g/mL的蔗糖及乳糖中Annexin-Ⅴ+/PI+精子的百分比显著低于对照组、直接冷冻组及3％甘油;而250 mmol/L及425 mmol/L海藻糖中Annexin-Ⅴ+/PI+精子的百分比显著低于直接冷冻组，与对照组及3％甘油间无显著性差异。200IU/mL、300IU/mL CAT，3 mmol/L、4 mmol/L GSH及200IU/mL SOD显著低于直接冷冻组，但与对照组及3％甘油无显著性差异。此外，还发现Annexin-Ⅴ+/PI+精子的百分比在EG处理组中最低，在酶类及海藻糖中很高。
　　本研究结果表明，添加适宜浓度的抗冻剂、糖类、抗氧化剂对冷冻-解冻后的猪精子具有一定的保护作用，能提高解冻后精子的活率、活力，抑制Caspase基因的表达及Caspase-3，-6/9和-8蛋白酶活性，减少猪精子冷冻过程中PS的外翻。研究的结果将为进一步选择适宜的抗冻保护剂、糖类和抗氧化剂，优化和改善猪冷冻精液的保存效果具有重要的科学意义。

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作者
何莲;
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作者单位

四川农业大学;

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授予单位四川农业大学;
学科动物遗传育种与繁殖
授予学位硕士
导师姓名曾长军;
年度 2014
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 S828.34;
关键词
猪精子; 冷冻保护剂; 细胞凋亡; 抗氧化剂; 人工授精;

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