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【6h】

基于G-四链体—hemin DNA酶的金属离子传感器的设计及其荧光底物的筛选

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摘要

第一章 绪论

第一节 关于G-四链体的介绍

1.1.1 G-四链体的结构介绍

1.1.2 G-四链体的功用

第二节 G-四链体-hemin DNA酶及其在金属离子传感器中的应用

1.2.1 G-四链体-hemin DNA酶

1.2.2 G-四链体-hemin DNA酶在金属离子传感器设计中的应用

第三节 G-四链体-hemin DNA酶催化氧化的荧光底物

1.3.1 荧光底物的优点

1.3.2 荧光底物在G-四链体-hemin DNA酶传感器设计中的应用

1.3.3 荧光底物发展面临的问题

第二章 利用G-四链体-hemin DNA酶与RNA切割酶的协同作用设计Pb2+“turn-on”传感器

第一节 实验部分

2.1.1 实验仪器与试剂

2.1.2 Pb2+的检测

2.1.3 实际样中Pb2+回收率的检测

第二节 结果与讨论

2.2.1 基于双DNA酶协同作用的Pb2+传感器的设计

2.2.2 Pb2+检测的灵敏度和重现性

2.2.3 Pb2+检测的选择性

2.2.4 Pb2+检测的实际应用

第三节 结论

第三章 Cu2+“turn-off”传感器的设计

第一节 实验部分

3.1.1 实验仪器与试剂

3.1.2 Cu2+的检测

3.1.3 hemin的紫外吸收光谱

3.1.4 实际水样中Cu2+回收率的检测

第二节 结果与讨论

3.2.1 Cu2+‘‘turn-off”传感器的设计原理

3.2.2 hemin的紫外吸收光谱

3.2.3 长链的优化选择

3.2.4 Cu2+检测的灵敏度和重现性

3.2.5 Cu2+检测的选择性

3.2.6 Cu2+检测的实际应用

第三节 结论

第四章 G-四链体-hemin DNA酶传感器的荧光底物的筛选

第一节 实验部分

4.1.1 实验仪器与试剂

4.1.2 荧光底物的对比实验

4.1.3 “turn-on”模式的Cu2+荧光检测——tyramine HCl作为荧光底物

第二节 结果与讨论

4.2.1 用于筛选的七种候选荧光底物

4.2.2 荧光底物反应条件的优化

4.2.3 荧光底物的氧化反应随时间的变化

4.2.4 利用荧光底物检测G-四链体GatG4

4.2.5 Tyramine HCl在基于G-四链体-hemin DNA酶的Cu2+传感器中的应用

4.2.6 以H2O2或H2O2相关分析物检测为目的的G-四链体-hemin DNA酶传感器的荧光底物筛选

第三节 结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

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摘要

G-四链体这种特殊DNA二级结构,可以与氯化血红素(hemin)结合形成G-四链体-hemin DNA酶,催化H2O2氧化ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)的反应,产物ABTS+在波长420 nm左右有明显的吸收峰。G-四链体-hemin DNA酶已被广泛应用于传感器设计中。本文结合了G-四链体-heminDNA酶和金属离子特异性的DNA/RNA切割酶,分别设计了用于快速简便地检测Pb2+和Cu2+的两种传感器。另外,为了进一步提高G-四链体-hemin DNA酶传感器的检测灵敏度,本文筛选了适用于G-四链体-hemin DNA酶的荧光底物。
   在Pb2+“turn-on”传感器中,利用了Pb2+特异性的RNA切割酶和G-四链体-hemin DNA酶的协同作用实现了免标记传感器的设计。其中,底物链设计为一个分子内的茎-环结构,一端的富G序列被部分包埋于双链的茎结构当中而不能形成G-四链体。在Pb2+的的存在下,茎-环结构的环部被切成两段,伴随着分子间二倍体结构的解缔,富G序列被释放出来并折叠成G-四链体。把底物设计为分子内的茎-环结构,可以有效地降低检测体系的背景信号值。而RNA切割酶和G-四链体-hemin DNA酶对信号的协同放大作用,可以进一步提高了检测的灵敏度。该种“turn-on”类型的比色传感器对Pb2+的检出限为14nM。把Pb2+的RNA切割酶换成其他金属离子特异性的DNA/RNA切割酶,可以轻易地将这种传感器的设计思路应用到其它金属离子传感器的设计当中。
   在Cu2+“turn-off”传感器的设计中,重构了Cu2+特异性的DNA切割酶,利用了两条寡核苷酸链,其中长链可以形成分子内的茎-环结构,其环部在与短链结合后可以形成Cu2+特异性的DNA切割酶。把两段富G序列连接在长链茎-环结构的两端使其形成双分子的G-四链体结构。当底物链在Cu2+的存在下被切成两段以后,伴随着稳定性的下降,双分子的G-四链体结构被破坏,导致检测体系的催化活性降低。该方法可以实现Cu2+高灵敏度和高选择性的检测,对Cu2+的检出限为16.6 nM。
   在G-四链体-hemin DNA酶的荧光底物的筛选研究中,选取了7种荧光底物进行了对比研究。其中,对比有无G-四链体存在的体系,tyramine HCl(酪胺)给出的信噪比最大。其适用的传感器类型为:目标物的存在可以引起G-四链体-hemin DNA酶的生成或破坏,进而引起体系的检测信号发生变化。而对比有无H2O2存在的体系,10-乙酰基-3,7,-二羟基吩恶嗪(ADHP)给出的信噪比最大,其适用的传感器体系为:H2O2的检测或其他可以导致H2O2生成的目标物的检测。将tyramine HCl应用于已报道的基于G-四链体-hemin DNA酶的Cu2+传感器中。相比于比色分析,荧光分析可以将Cu2+的检测限从4nM降为0.7nM。

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