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松花江流域底泥真菌的分类与鉴定

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第一章 绪论

第一节 研究背景

1.1.1 松花江流域环境特征

1.1.2 底泥成分及与河流水体的关系

1.1.3 底泥中的真菌

第二节 真菌在生态环境修复中的作用

1.2.1 石油污染土壤中真菌的降解作用

1.2.2 菌根真菌在土壤修复方面的应用

1.2.3 水生真菌在环境修复中的应用

1.2.4 底泥真菌在环境修复中的应用

第三节 真菌的分类与鉴定方法

1.3.1 经典分类鉴定方法

1.3.2 化学分类法

1.3.3 数值分类法

1.3.4 遗传分类法

第四节 真菌的分类系统

第五节 微生物的系统发育

1.5.1 系统发育分析

1.5.2 构建分子系统进化树的方法

第六节 DGGE技术在环境生态研究中的应用

1.6.1 检测传统方法无法培养的菌种

1.6.2 用于环境中微生物变化的动态监测

1.6.3 研究微生物类群的多样性

第七节 研究内容与目的

1.7.1 研究内容

1.7.2 研究目的

第二章 实验材料与方法

第一节 采样点的设置

第二节 底泥中总DNA的提取

2.1.1 试剂与仪器

2.1.2 实验方法

第三节 巢式聚合酶链式反应

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 实验方法

第四节 DGGE凝胶电泳

3.1.1 试剂与仪器

3.1.2 实验操作

第五节 显著性条带分析

4.1.1 试剂与仪器

4.1.2 实验操作

第三章 实验结果与分析

第一节 底泥中DNA的提取

第二节 巢式聚合酶链式反应扩增结果

第三节 DGGE凝胶电泳

3.3.1 DGGE电泳图谱

3.3.2 Quantity One软件分析

第四节 显著性条带分析

3.4.1 切割条带的选择

3.4.2 GenBank数据库基因比对

3.4.3 所测序列系统进化树的构建

第五节 底泥真菌在环境修复中的作用

3.5.1 底泥真菌与环境因子间的相关性分析

3.5.2 松花江底泥真菌在环境修复中的作用

3.5.3 嫩江底泥真菌在环境修复中的作用

3.5.4 第二松花江底泥真菌在环境修复中的作用

3.5.5 牡丹江底泥真菌与环境修复中的作用

第四章 研究结论与展望

第一节 实验结论

第二节 展望

参考文献

致谢

附录

个人简历

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摘要

本文运用聚合酶链式反应(PCR)与变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)相结合对松花江底泥中的真菌群落结构进行了研究,在全面了解了松花江流域四大干流底泥真菌多样性的基础上,以现代分子生物学手段对松花江流域优势性和特异性底泥真菌进行了分类与鉴定。与传统的微生物培养技术相比,该方法可获得更全面的真菌群落结构信息,克服了传统方法中因培养条件的限制而致使大量真菌无法被分类、鉴定的缺陷。该方法还具有快速、全面、灵敏度高的特点,是一种突破了传统方法的建立在现代分子生物学层面上的菌种分类鉴定技术。
   本文应用DGGE变性梯度凝胶电泳技术对松花江干流、嫩江干流、第二松花江干流、牡丹江干流89个采样点的底泥真菌的群落结构进行了相似性和多样性分析,结果表明,松花江流域底泥真菌具有局部相似,整体差异的总体特征。松花江干流底泥沉积物真菌多样性最高,牡丹江干流底泥真菌多样性最低,嫩江干流和第二松花江居中。
   对流域中普遍存在的优势性条带和各采样点独有的特异性条带进行切割回收和测序,测序结果与GenBank数据库进行比对,共有46条条带测序成功,其中27条序列属于非培养得到的真菌(Uncultured fungus),12条无法鉴定出菌属(Unidentified)。通过系统进化树找到鉴定菌属间的进化关系,其中共有9种未发现近似菌属。
   对鉴定出的菌属在环境中起到的作用进行了分析评价,按功能划分,鉴定出的菌属大致可分为环境修复功能菌和致病菌两类,如青霉菌,曲霉菌,白腐霉菌等为环境修复常见功能菌;蛙粪霉菌属,轮枝孢属等为致病菌;也鉴定到极端环境下的具有环境修复作用的微生物:耐冷酵母Guehomyces和假丝酵母属。
   以第二松花江为重点研究对象,研究了环境因子与所鉴定真菌间的相互关系,结果发现各采样点真菌对该地环境具有指示及修复作用。如在总磷含量和氨氮含量最高的采石场发现了对磷化物和几丁质等氮化物具有较强耐受性和降解作用的拟青霉属(Simplicillium),今后可在此基础上寻找适合的培养条件,以分离筛选出对磷、氮具有高降解率的功能性修复菌。

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