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围产期食物限制对大鼠神经行为发育空间学习与记忆能力的影响

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本文主要缩略语表

第一章 引言

第一节 研究背景

1.1.1 围产期与宫内发育受限

1.1.2 围产期营养不良的神经发育研究

1.1.3 围产期营养不良的动物模型

1.1.4 围产期营养不良与脑组织发育

1.1.5 胎儿体重

1.1.6 围产期营养不良与后期代谢性疾病

第二节 研究目的、意义和内容

1.2.1 本论文的研究目的

1.2.2 意义

1.2.3 主要研究内容

第三节 本论文的结构安排

第二章 围产期食物限制动物模型的建立

第一节 前言

2.1.1 动物脑发育与人类的相关关系

2.1.2 围产期食物限制的测量指标

第二节 材料与方法

2.2.1 主要实验材料

2.2.2 模型制作主要流程

2.2.3 测定指标

2.2.4 统计学处理

第三节 结果

2.3.1 同产期食物限制对孕鼠体重及窝效应的影响

2.3.2 新生鼠体重洲量

2.3.3 新生鼠肛殖距测量

第四节 讨论

2.4.1 动物模型以及影响因素

2.4.2 围产期食物限制对孕鼠体重及窝效应的影响

2.4.3 围产期食物限制影响子鼠发育的可能机制

2.4.4 小结

第三章 围产期食物限制对新生子代大鼠身体发育和神经行为的影响

第一节 前言

3.1.1 神经行为发育的概述

3.1.2 神经行为发育的测试项目

3.1.3 神经行为发育的测试过程

3.1.4 神经行为发育测试中应特别注意的问题

3.1.5 神经发育中离子通道功能的变化

第二节 材料与方法

3.2.1 主要实验材料

3.2.2 主要实验流程

3.2.3 数据统计处理

第三节 结果

3.3.1 围产期食物限制对子代新生大鼠身体生长的影响

3.3.2 围产期食物限制对子代新生大鼠神经反射的影响

第四节 讨论

3.4.1 围产期食物限制对子代新生大鼠身体生K的影响

3.4.2 围产期食物限制对子代新生大鼠神经反射的影响

3.4.3 小结

第四章 围产期食物限制对成年雄性子代人鼠空间学习与记忆能力的影响

第一节 前言

4.1.1 学习和记忆的概述

4.1.2 学习和记忆的类型

4.1.3 学习障碍与遗忘

4.1.4 Morris水迷宫-一个用于测量认知功能的工具

4.1.5 长时程增强

4.1.6 围产期营养不良导致海马依赖性认知下降的研究进展

第二节 材料和方法

4.2.1 主要实验材料

4.2.2 主要实验流程

4.2.3 数据统计分析

第三节 结果

4.3.1 围产期食物限制对子代成年大鼠水迷宫学习与记忆行为的影响

4.3.2 围产剃食物限制对海马CA1区LTP的影响

第四节 讨论

4.4.1 围产期食物限制对子代成年大鼠空间学习与记忆行为的影响

4.4.2 围产期食物限制对子代成年大鼠海马CA1区LTP的影响

4.4.3 研究围产期食物限制的意义

4.4.4 小结

第五章 围产期食物限制对成年雄性子代大鼠海马神经元型一氧化氮合酶阳性细胞密度的影响

第一节 前言

5.1.1 一氧化氮及一氧化氮合酶

5.1.2 神经元型一氧化氮合酶在学习与记忆过程中的变化和作用

5.1.3 NO及nNOS与LTP的关系

5.1.4 一氧化氮合酶的免疫组化测量

第二节 材料与方法

5.2.1 主要实验材料

5.2.2 主要实验流程

5.2.3 统计学分析

第三节 结果

5.3.1 围产期食物限制对子代大鼠海马各区nNOS阳性细胞密度的影响

5.3.2 围产期食物限制影响子代大鼠海马各区nNOS阳性细胞密度的区域性差异

第四节 讨论

5.4.1 NO在学习与记忆中的作用

5.4.2 NO在LTP的关系

第六章 主要结论

第一节 本论文主要结论

第二节 主要创新点

第三节 研究前景展望

第七章 参考文献

致谢

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果

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摘要

目的:
   成年和老年食物限制(food restriction,FR)可以产生许多有益的生物学效应,包括延长了生命周期、延缓衰老和疾病的进程、提高学习和记忆能力及降低药物的毒性等。然而,围产期食物限制可导致胎儿宫内发育受限(intrauterinegrowth restriction,IUGR),主要表现为新生儿出生后体重降低、生长缓慢、学习成绩不良。实验动物研究表明,围产期食物限制或营养不良除导致体重降低、生长缓慢外,还表现为一些行为发育延迟及成年社会行为和空间学习能力下降等。由于围产期营养不良对人类的生命和健康有极大危害,因此研究其对大鼠出生后神经行为发育(发育转折点)及对认知能力的影响有利于进一步认识人类IUGR并为发展保护人类胎儿IUGR的策略提供有益的资料。本研究首先建立围产期50%食物限制(FR50)Wistar大鼠模型,之后分别观察围产期FR50对新生期子代雌雄大鼠神经行为发育(包括身体发育和神经反射)的影响。由于新生期神经行为发育的延迟或损伤往往与后期(包括幼年和成年)的认知行为下降有关,因此又研究了子代成年雄性大鼠空间学习与记忆能力、海马CA1区突触可塑性及海马一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)阳性神经元密度的变化,以揭示认知行为变化的可能机制。
   方法:
   实验第一部分:围产期50%食物限制大鼠模型的建立。为了研究围产期营养不良对神经行为发育和认知能力的影响,需要有合适的动物模型。通常有蛋白限制法和食物限制法。鉴于前者在饲料制作方面困难,所以采用后者制作模型。根据食物限制的程度,通常又分为轻度(30%)、中度(50%)和重度(70%)食物限制法。本研究采用了中度食物限制法。健康成年(体重250-280 g)14周龄wistar雌鼠与雄鼠同笼(雌雄比2-3:1)。之后,每日早晨检查雌鼠阴道口或阴道涂片,发现阴道栓或阴道涂片中有大量精子存在记为大鼠妊娠第0天(embryonic day0,E0),分笼喂养。将妊娠的雌鼠随机分为对照组(n=18)和模型组(n=16)。对照组自由摄食,并记录每日饲料消耗量。模型组从妊娠的E0到E6自由摄食,从妊娠的E7到仔鼠出生的21天(postnatal day21,PD21)进行食物限制,食物限制量为对照组大鼠每日平均饲料消耗量的50%。两组孕鼠均予充足饮水。分别于妊娠的E1、E7、E14和E21测定孕鼠体重。大鼠自然分娩,仔鼠出生的当天记为PD0,分别于仔鼠出生的PD1、PD7、PD10、PD14和PD21称重。发现FR50新生仔鼠体重明显低于正常组新生鼠,且孕鼠E14和E21体重也明显低于正常组孕鼠。表明本实验方法模拟了围产期营养不良状态,成功复制出胎鼠IUGR,有助于下一步研究新生子代大鼠神经行为发育及围产期营养不良状态对认知能力的影响。
   实验第二部分:围产期食物限制对子代新生Wistar大鼠神经行为发育的影响。以肛殖距判断仔鼠的性别。典型的神经行为发育评估包括身体生长和神经反射两部分。身体生长包括开耳(PD2-PD5)、睁眼(PD14-PD17)、门齿生长(PD8-PDl2)和毛发出现(PD11-PD14)。神经反射包括翻正反射(PD3-PD7)、负性趋地反射(PD6-PD10)和悬崖回避反射(PD4-PD9)。比较对照组和食物限制组新生仔鼠神经发育的变化。
   实验第三部分:围产期食物限制对子代成年雄性大鼠空间学习与记忆能力及海马CA1区长时程增强(10ng-term potentiation,LTP)的影响。大鼠出生后70天(PD70),运用Morris水迷宫测试空间学习与记忆能力。Morris水迷宫测试包括定位航行实验(place navigation test)和空间探索(probe trial performance)两个部分。定位航行实验历时5天,每天分上下午两个时间段训练。在每个时间段训练4次,分别从4个坐标象限的中点将大鼠面向池壁轻轻放入水中,记录大鼠在120 s找到平台的时间,即逃避潜伏期(escape latency)。若在120 s内找不到平台,则将大鼠引导到平台上并保持15 s。第6天撤除平台作空间探索实验,选与平台象限相对象限的中点为入水点将大鼠放入水中,记录120 s内大鼠跨越平台的次数及在目标象限的搜索时间百分比。之后,在海马CA1区在体记录场兴奋性突触后电位(fEPSP)。单极记录电极垂直插入海马CA1区锥体细胞树突丛(前囟后3.4 mm,中线旁开2.5 mm),双极刺激电极插入同侧海马Schaffer侧枝(前囟后4.2 mm,中线旁开3.5 mm)。调整记录电极及刺激电极深度,至记录到最大场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)为止。海马CA1区LTP区的记录参数为:以波宽0.2ms、频率0.033Hz的测试刺激,作用于大鼠海马CA3区Schaffer侧枝,诱导海马CA1区锥体细胞树突丛场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。以fEPSP幅度的50%电流强度作为最适刺激强度。记录30 min fEPSP后进行高频刺激。高频刺激由10串200 Hz的方波组成,串间隔2 s。之后,用相同的波宽(频率0.033Hz)记录120 min fEPSP。
   实验第四部分:围产期食物限制对子代成年雄性大鼠海马神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)阳性细胞密度的影响。由于空间学习与记忆能力的变化及海马CA1区LTP的诱导和维持需要兴奋性神经递质谷氨酸的释放。一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一种逆向信使,促进突触前神经元谷氨酸的释放,从而易化了在突触后神经元上记录的LTP。因此,进一步用免疫组化方法观察海马三个亚区nNOS阳性细胞的密度。以期从一氧化氮的角度研究围产期食物限制消弱了子代空间学习和记忆能力的机制。
   结果:
   1)围产期食物限制导致新生雌雄大鼠身体生长延迟,包括开耳、门齿生长、毛发和睁眼延迟。
   2)围产期食物限制导致雌雄新生大鼠神经反射延迟,包括翻正反射和:悬崖回避反射。另外,食物限制还导致雄性新生大鼠负性趋地反射延迟,但不影响雌性新生大鼠负性趋地反射。
   3)围产期食物限制导致成年雄性子代大鼠空间学习与记忆能力下降。
   4)围产期食物限制导致成年雄性子代大鼠海马CA1区突触可塑性降低。
   5)围产期食物限制降低了海马三个亚区(CA1区、CA3区和齿状回)nNOS阳性细胞的密度。
   结论:
   1)围产期食物限制导致新生大鼠神经发育延迟;
   2)围产期食物限制对新生大鼠小脑的发育可能具有性别依赖性;
   3)围产期食物限制可能通过抑制NO的产生降低了海马突触可塑性,从而导致空间学习与记忆能力的降低。

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