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【6h】

苏云金芽孢杆菌Bt15A3菌株crylC基因的克隆与表达

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目录

文摘

英文文摘

第一部分:前言

一、苏云金芽孢杆菌简介

二、苏云金芽孢杆菌ICP蛋白及其编码基因

三、苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定

四、苏云金芽孢杆菌的遗传改良工作

五、抗性问题

六、关于crylC基因

七、本文的研究目的与意义

第二部分:材料和方法

一、实验材料

1.1菌株及培养条件

1.2试剂

1.3主要仪器

二、实验方法

2.1 PCR模板的制备及扩增体系

2.2质粒的提取及检测

2.3生物测定

2.4 H血清型鉴定

2.5 PCR产物的克隆

2.6外源片断的亚克隆

2.7Bt菌株的电穿孔转化

2.8 Bt晶体蛋白的SDS-聚丙烯凝胶电泳检测

第三部分:结果与分析

一、Bt 15A3菌株的血清定

二、Bt 15A3菌中全长crylC基因的克隆

三、crylC基因在无晶体Bt菌株中的表达

3.1电击转化无晶体Bt菌株1715

3.2电转化Bt 3#消晶体株Bt 3#(Cry-)

四、多功能基因工程菌的构建

4.1以Bc 9509为受体构建转crylC基因工程菌

4.2以3#菌株为受体转crylC基因工程菌的构建

4.3以Bt subsp.kenyae 7404为受体进行工程菌的构建

第四部分、讨论

一、以T-vector为载体克隆PCR产物

二、全长crylC基因的克隆

三、影响电转化效率的因素

四、以增产菌Bc 9509为受体构建双价工程菌

五、转crylC基因菌株的毒力

第五部分、小结

参考文献

致谢

附表

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摘要

Bt15A3是分离自土壤的野生菌株,它含有多种优良基因(cry1Aa、cry1Ac、cry1C、cry1D、cry1I及cry2)组合,对棉铃虫、甜菜夜蛾、小菜蛾及美国白蛾均有较高的活性.该文首先对Bt 15A3菌的鞭毛抗原血清型进行了鉴定,发现该菌株属于H21血清型,colmeri亚种.目前国内外尚无使用Bt colmeri亚种为生产菌种的报导.因此Bt15A3菌株的发现与开发,不但为发掘中国野生Bt资源作了有益的尝试,而且为Bt生产菌株的更新换代提供了后备菌株.利用自行设计的引物1Ca0和1Ca2对Bt 15A3中的cry1C基因进行PCR扩增.得到的4.0kb的PCR产物包括cry1C基因的所有编码区及起始密码子上游约400bp的启动子及其上游调控区.以增产菌蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)9509为受体构建转cry1C基因的杀虫、增效双功能工程菌Bc9509-1C,使Bc9509表达出了杀虫晶体蛋白.生测结果表明,cry1C基因的导入使Bc9509获得了对甜菜夜蛾的毒杀作用.Bt15A3菌株中cry1C基因的获得,可以更加深入的了解该菌株中cry1C基因的序列特性,丰富了中国具独立知识产权的cry基因资源.为构建用于联合使用的多功能生防工程微生物及培育抗虫转基因作物提供具独立的知识产权的高效基因源.

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