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产对香豆酸及其衍生物的酿酒酵母菌株的构建与优化

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第1章 文献综述

1.1 植物次生代谢产物简介

1.2 对香豆酸及其衍生物简介

1.3 合成生物学在对香豆酸及其衍生物的生物合成中的应用

1.4 本课题的研究内容及意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 基因元件的获得

2.3 分子实验操作

2.4 发酵培养方法

2.5 混菌培养细胞个数的测定

2.6 产物的提取及检测方法

第3章 前体物质对香豆酸菌株的构建与优化

3.1 引言

3.2 酿酒酵母功能模块的构建

3.3 产对香豆酸酿酒酵母菌株的构建及表达水平的调节

3.4负反馈抑制相关基因的过表达

3.5 竞争路径基因的敲除

3.6 外源添加L-酪氨酸对对香豆酸产量的影响

第4章 合成咖啡酸酿酒酵母菌株的构建与优化

4.1 引言

4.2 功能模块的构建以及不同表达水平的调节

4.3 基因hpaB和hpaC的适配性对咖啡酸产量的影响

第5章 利用混菌平台发酵生产柚皮素

5.1 引言

5.2 合成柚皮素的酿酒酵母菌株的构建

5.3 混菌系统的建立及优化

5.4 发酵条件的优化对混菌系统的影响

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢

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摘要

苯丙素类化合物及黄酮类化合物作为均以对香豆酸为出发前体骨架化合物的一大类天然产物,具有广泛的生物活性及药理活性,如抗氧化、抗癌、抗炎抗菌等,同时也在化妆品及食品工业领域具有广泛应用,其生物合成的研究在合成生物学中占据很大的比重。因此,对此类化合物通过合成生物学进行生物合成的构建及优化具有重要意义。 本研究以三个节点化合物作为代表来开展对苯丙素类及黄酮类化合物的生物合成的研究。首先为前体化合物对香豆酸,利用基因工程及代谢工程原理,过表达了酪氨酸反馈抑制相关基因ARO4和ARO7,并利用loxP-Cre系统对旁路相关基因ARO10和PDC5进行敲除,得到对香豆酸的产量为87.56 mg/L,是对照菌株的2.05倍,其后有探究了外源添加酪氨酸对产量的影响,确定当酪氨酸的外源添加量为1mM时,对香豆酸产量提高了近一倍。其次,以咖啡酸作为苯丙素类化合物代表,本研究通过探究苯环羟化酶 hpaBC不同拷贝数对咖啡酸产量的影响发现,随着拷贝数的增加,咖啡酸的产量也随之提高;此外,本研究通过不同来源的hpaB及hpaC进行组合筛选,对hpaB与hpaC进行适配,同时也对羟化酶与底盘菌株进行适配,通过实验结果可知,不同来源的 hpaB与hpaC以及与底盘细胞之间的适配关系不同导致咖啡产量的差异较大,最终筛选出最适配的(也就是咖啡酸产量最高)的为绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的hpaB和大肠杆菌(Escherichia coli)来源的hpaC,得到咖啡酸的产量为37.61 mg/L。至于黄酮类化合物,本研究选取了平台化合物柚皮素作为研究对象,通过混菌系统对柚皮素的生产进行优化,将导入柚皮素合成路径的酿酒酵母菌株与经过改造的产酪氨酸的大肠杆菌菌株混合培养,并通过对培养基成分的优化以及总接种量和两菌接种比例的优化,最终获得了21.16 mg/L的柚皮素产量,8倍于对照菌株。 本研究对对香豆酸以及代表化合物咖啡酸及柚皮素的研究,对苯丙素类化合物及黄酮类化合物的生物合成具有借鉴意义。

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