人骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的DNA甲基化调控机制

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目的:
　　(1)优化人外分泌汗腺细胞（sweat gland cells，SGCs）的分离方法，以高效地获取原代汗腺细胞。
　　(2)建立体外诱导人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向汗腺样细胞分化的共培养体系，并观察诱导后细胞形态、表型和相关基因表达的改变。
　　(3)探讨DNA甲基化在BM-MSCs向汗腺样细胞转分化过程中的调控作用，并寻找甲基化调控的靶点基因。
　　方法：
　　（1）取新鲜的全皮层组织，剪成小块微粒，分别用不同的方法（胰酶+胶原酶，单纯胰酶，单纯胶原酶）消化分离汗腺，观察消化过程中出现游离汗腺的时间；微量移液器挑取游离汗腺，进行体外培养，观察细胞的贴壁情况和生长状态；9天后，流式细胞仪检测存活下来的细胞的增殖能力，并利用免疫细胞化学检测汗腺细胞的表面抗原CK7和CEA的表达状况。
　　（2）购买骨髓间充质干细胞系，体外培养、扩增，并进行细胞的成脂肪、成骨细胞分化能力的鉴定；选取第三代的BM-MSCs与热休克后汗腺细胞（47℃）进行 Transwell+诱导因子的共培养，分别于第3、6、9天观察细胞形态学的变化，设置汗腺细胞为阳性对照组。细胞免疫荧光技术检测细胞汗腺表面抗原CK7和CEA的表达，RT-PCR和Western blot分别检测CK7、CEA在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。
　　（3）采用Illumina450K甲基化芯片检测转分化前后细胞的甲基化水平的变化，筛选甲基化差异性基因，随后对差异基因进行生物信息学分析（差异位点筛选、聚类层次分析、Gene Ontology、KEGGPathway分析、生物学功能注释、蛋白-蛋白相互作用）；结合预实验结果和相关文献，对若干候选基因(HDAC4、PAX6、MMP1、EDA等)，用甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)进行初步验证，然后通过Mass Array飞行质谱技术对特定基因位点进行重点分析；最后，构建特定基因的重组质粒，体外转染 BM-MSCs，观察质粒转染后细胞表型和相关基因的表达情况。
　　结果：
　　（1）酶联合消化法(A组)在2h时，镜下可见较多游离的汗腺细胞；胰蛋白酶-EDTA法（C组）获取的细胞贴壁很差；胶原酶法（B组）在6h左右时，才有较多的游离汗腺出现。A组和B组获取后的汗腺细胞贴壁良好，生长增殖正常,流式检测结果显示：A组和B组细胞的增殖指数分别为(18±4)％和(17±6)%，无统计学差异。免疫细胞化学表型鉴定结果显示：酶联合消化组和胶原酶组获取的细胞CEA、CK7阳性率未见明显差异。
　　（2）通过多向分化潜能实验，我们证实 BM-MSCs可以分化为脂肪细胞和骨细胞。Transwell+诱导因子共培养3天时，BM-MSCs的细胞形态基本没有变化，仍呈长梭形；共培养9d后，细胞形态呈多样化，部分细胞出现近似于汗腺样细胞的改变，由诱导前的长梭形变为扁平不规则状，并且逐步聚集呈向心性生长。对汗腺样细胞进行细胞免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测，都发现其不同程度地表达汗腺细胞表面抗原CK7、CEA。
　　（3）采用 Illumina甲基化芯片，在全基因组范围内初步筛选出甲基化水平明显差异的探针位点693个；甲基化差异性基因有437个基因（升高97个，下降350个）；差异位点区域分布显示：主要分布在N_Shore和CpG islands区域，基因区域分布主要集中在Genebody和TSS200区域。Gene Ontology和KEGG pathway分析显示：主要涉及细胞命运界定、信号转导与基因表达、转录阻遏、外胚层发育等生物学过程。MSP和Mass Array飞行质谱结果显示：与诱导前BM-MSC相比，诱导后汗腺样细胞中HDAC4的甲基化水平明显下调，与甲基化芯片结果大体一致。转染 HDAC4质粒载体后，免疫细胞化学和 RT-PCR结果都显示CEA表达明显上调。
　　结论：
　　（1）胰蛋白酶和胶原酶联合应用能明显缩短汗腺细胞的分离时间，且不影响细胞的增殖活性和抗原表达情况。
　　（2） BM-MSCs和热休克汗腺间接共培养体系(Transwell+诱导因子)提供了适宜转分化的微环境，并且通过该方法成功的获得了汗腺样细胞。
　　（3）作为表观遗传修饰的重要方式—DNA甲基化，参与并影响着 BM-MSCs向汗腺样细胞转分化的过程。
　　（4）HDAC4可能是对CEA选择性的入核转录进行调控，表现在转染HDAC4质粒后，CEA表达上调，进而影响着转分化为汗腺样细胞的生物学过程。

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作者
赵换军;
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作者单位

天津医科大学;

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授予单位天津医科大学;
学科临床医学
授予学位硕士
导师姓名付小兵;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类烧伤及烫伤（灼伤）;
关键词
汗腺细胞; 骨髓间充质干细胞; DNA甲基化; 细胞形态; 靶点基因; 调控机制; 表观遗传;

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