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慢病毒介导siRNA干扰ERK2抑制关节粘连的研究

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摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1．材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果

2．1 实验动物观察与管理

2．2 挛缩角测量结果

2．3 大体观察评分结果

2．4 生物化学测定

2．5 慢病毒携带siRNA在组织中的转染、表达情况

2．6 HE染色结果及观察

2．7 免疫组化染色结果及观察

3 讨论

3．1 慢病毒载体的研究现状

3．2 慢病毒载体转染的靶向性

3．3 慢病毒介导siR从的局部导入机制及其优势

3．4 ERK2 siRNA抑制粘连形成的疗效及其可能机制

3．5 动物模型的可行性

4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 膝关节粘连的研究及治疗进展

致谢

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摘要

目的:本课题通过建立兔膝关节滑膜切除术模型，急性期内局部注射携带小分子干扰RNA（small interfering RNA， siRNA）的慢病毒，然后通过siRNA干扰ERK2，进而阻断SMAD和MAPK通路来抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白表达，从而抑制关节粘连形成。然后观察其后期效果，并探讨其作用机制。
　　方法:选择健康成年日本大耳白兔30只，随机分为对照组（A组）、Ms siRNA组（B组）、ERK2 siRNA组（C组），每组10只。所有动物在无菌相同的条件下均行右侧膝关节滑膜切除术，并搔剐髌上囊区域，完成兔膝关节滑膜切除术模型。手术完毕，将兔右膝关节用管型石膏固定于屈曲140°位，时间为4周，对左侧膝关节不行任何处理。在切口闭合后的第3天及第7天，A组局部注射0.1ml无病毒载体培养液、B组局部注射0.1ml慢病毒介导的MS siRNA的培养液、C组局部注射0.1ml慢病毒介导的ERK2 siRNA的培养液。每组兔子测量膝关节挛缩角度，方法是采用在固定伸膝力作用下，测量膝关节挛缩角度。动物麻醉完毕，除去管型石膏，平卧位固定右大腿，将右小腿膝下10cm处用绷带套住，另一端系弹簧秤，施加均匀的水平牵引力(5N)，被动伸直膝关节。拍摄右膝关节的X线片，股骨与胫骨长轴的夹角，定义为挛缩角。然后动物行右膝关节的大体观察，一盲法观察者观测，半定量计分，并作半定量评估。记分标准:无粘连为0分，薄膜样弱粘连为1分，轻度粘连为2分，中度粘连为3分，严重的纤维性粘连为4分。大体观察之后，将测完角度的兔子处死，在髌上囊处取粘连组织，标本烘干，贮存于-20℃冰箱中。胶原中含有12.5％的羟脯氨酸（质量），故可通过测量粘连组织中轻脯氨酸的含量来折算总胶原含量。先测出标准羟脯氨酸浓度的紫外线吸光度，绘制标准曲线紫外线分光光度仪在560μm处测溶液吸光率，再测定样品羟脯氨酸吸光度，得出羟脯氨酸的含量。进而得出总胶原含量。接着取带着粘连组织的右膝关节，在10％福尔马林—10％硝酸混合液中固定脱钙1周（大头针可轻松刺入骨组织），冲洗后取髌上囊周围的粘连组织，经常规处理制成切片。术后28天荧光显微镜下观察局部病毒携带siRNA对细胞的转染情况，并通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)和免疫组织化学染色观察损伤局部组织瘢痕粘连状况。所有数据经过SPSS11.0统计软件包处理，结果用X士S表示。由单因素方差分析组间t检验进行比较，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果:对照组（A组）、Ms siRNA组（B组）各有一只兔子死亡。1只ERK2 siRNA组（C组）兔子因石膏管形出现压迫性溃疡不能使用，除去这3只兔子，留有27只动物作为研究对象。荧光显微镜下观察到4w后在关节腔周围组织中有大量增强型绿色荧光蛋白得以表达，表达部位主要集中在关节囊周围中，并且距损伤边缘越远，绿色荧光密度越低。转染后第28天检测到的荧光强度表明，荧光素酶基因表达，局部注射的慢病毒介导siRNA成功导入靶细胞。Ms siRNA组（B组）关节屈曲挛缩的角度（71°-91°，平均82°），与对照组（A组）差异不明显，无统计学意义(P＞0.05)。ERK2 siRNA组（C组）关节屈曲挛缩的角度（25°-38°，平均32°）明显低于Ms siRNA组和对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。大体观察时发现Ms siRNA组（B组）粘连成较厚的纤维粘连组织，而ERK2 siRNA组粘连教薄弱，对照组盲法半定量评分结果是3.14±0.556分，与对照组（A组）差异不明显，无统计学意义(P＞0.05)。而ERK2 siRNA组（C组）是2.16±0.408分，明显低于Ms siRNA组和对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。生物化学分析测得羟脯氨酸的质量，然后利用公式羟脯氨酸的质量×8得到胶原的质量，这样1mg干燥粘连组织中的总胶原含量是:Ms siRNA组（B组）134.03±11.68μg，与对照组（A组）差异不明显，无统计学意义(P＞0.05)。ERK2 siRNA组（C组）80.06±10.13μg，明显低于Ms siRNA组和对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。免疫组化及HE染色观察到对照组和Ms siRNA组粘连组织致密、粗糙，纤维瘢痕密布，两者在纤维细胞密度方面相差不大;与之相比，ERK2 siRNA组粘连组织稀疏、松散，且纤维细胞密度明显比Ms siRNA组和对照组低。
　　结论:局部导入慢病毒介导的以ERK2为靶向的siRNA能够安全有效地改善兔模型中关节粘连的形成;这项研究可能为预防关节粘连的形成提供了一种新的途径，涉及较大的动物及临床应用尚需进一步的研究。

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