小麦籽粒淀粉生物合成及淀粉分支酶基因(SBE-Ⅱb)的克隆与表达

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小麦在我国是仅次于水稻的第二大重要的粮食作物，其产量与品质是直接关系着人类食物的供应程度和营养水平。小麦籽粒的主要成分是淀粉，淀粉是以碳水化合物的形式储存的，人类80％左右的能量都是由淀粉提供；淀粉除作为食品外，在工业方面作为原材料的应用更加广泛：造纸、纺织、能源、化工、制药、机械、建筑等行业对淀粉的需求潜力很大，若小麦育种能够向专业化发展，那么不同的行业对淀粉的需求必将会再上一个台阶。因此深入研究小麦籽粒淀粉的生物合成，为以后利用生物技术来提高淀粉的产量及改良其品质奠定基础，对选育淀粉以及品质专用型的小麦具有重要意义。为此，本研究选用不同基因型的两个高淀粉和两个低淀粉含量的六倍体小麦为材料，对高、低淀粉含量的小麦品种籽粒灌浆过程中淀粉含量积累的动态变化、淀粉合成关键酶活性的动态变化、淀粉合成关键酶基因表达差异、同时对酶活性的动态变化与淀粉积累动态以及酶基因表达差异之间存在的关系进行了相关性分析。并且通过反转录的方法克隆得到了高淀粉小麦籽粒胚乳的SBEⅡb的cDNA，并构建了蛋白表达载体，在大肠杆菌中诱导进行过量表达并对其表达条件进行了优化，还分别构建了SBEⅡb基因的超量表达载体和SBEⅡb基因的RNAi干扰表达载体，并在模式植物中系统的分析了它们的分子特征、表达特性和功能活性等。主要结果如下：
　　1、小麦籽粒灌浆过程中总淀粉及淀粉组分的积累动态变化，结果表明高淀粉含量的品种和低淀粉含量的品种在籽粒淀粉积累量和积累速率上均存在明显的基因型差异。Logistic方程拟合淀粉积累过程发现，支、直链淀粉最终积累量取决于积累启动时间的早晚和积累速率的大小，而最大积累速率出现时间的早晚对其调节作用较小。
　　2、小麦籽粒灌浆过程中不同类型籽粒中的GBSS、SSS、SBE和DBE酶活性变化均呈现单峰曲线，峰值出现在12-24d不等。4个品种的GBSS酶活性均与直链淀粉的积累速率呈极显著正相关，与总淀粉的积累速率达到显著或极显著正相关，但与支链淀粉的积累速率的相关性不显著。SBE和SSS酶活性与总淀粉的积累速率和支链淀粉的积累速率呈显著或极显著正相关，而与直链淀粉积累速率的相关不显著。DBE活性与淀粉积累速率的相关性不显著，淀粉合成关键酶活性间的相关性分析表明高淀粉含量的品种DBE活性与SSS、GBSS和SBE达到显著性或极显著性水平，它们之间可能存在着协同作用。
　　3、采用实时荧光定量RT-PCR方法，对灌浆期籽粒淀粉合成酶相关基因的转录水平进行了检测和比较，并对其表达量与相应酶活性的相关性做了分析。结果表明，束缚态淀粉合成酶基因（GBSS）、可溶性淀粉合成酶基因（SSS）、淀粉分支酶基因（SBE）、淀粉去分支酶（DBE）酶活性均呈单峰曲线变化,利用实时荧光定量PCR技术检测9个基因在不同淀粉含量的4个供试品种花后不同时期的相对表达量,结果表明，在花后6d这些基因开始表达，在灌浆的中期花后12-18d不等有表达的小高峰，两个高淀粉含量的品种在不同时期的酶活性及其酶基因的相对表达量均比两个低淀粉含量的品种相对较高；这些基因表达谱与酶活性相关分析显示，除GBSS外其它几种淀粉合成酶基因均与相应酶活性呈显著或极显著正相关，而且GBSS酶活性到达峰值时间稍迟于DBE、SSS、SBE等酶，说明DBE、SSS、SBE基因可能主要通过转录水平来控制籽粒淀粉的合成，而GBSS基因可能主要通过转录后水平来控制籽粒淀粉的合成。
　　4、采用RT-PCR技术克隆了小麦胚乳基因SBEⅡb全长cDNA序列，同时构建了原核生物表达载体pET28（a+）-SBEⅡb，对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明，37℃，8h能诱导SBEⅡb融合蛋白的最大量表达，在0.5mmol/LIPTG浓度下可以成功表达出了SBEⅡb蛋白。为进一步体外研究SBEⅡb的物理化学性质及催化机理奠定基础。
　　5、构建SBEⅡb的RNAi表达载体，并对其转化烟草，检测其对直链淀粉合成的影响。以植物表达载体PZP35S为基础，构建了由组成型启动子35S调控的SBEⅡb基因的RNAi植物表达载体。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在转基因烟草中的相对表达量，并测定转基因植株中直链淀粉的含量和支链淀粉含量的变化。结果表明：经qRT-PCR证实SBEⅡb基因的表达量较对照下降，而且支链淀粉含量变化显著，直链淀粉较对照有上升但变化没有达到显著水平。
　　6、构建SBEⅡb基因的过量表达载体，将克隆得到的基因SBEⅡb构建到了植物表达载体pPZP35S上，通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片，经卡那霉素筛选、PCR扩增鉴定证明，SBE-Ⅱb基因已成功转入烟草细胞中，获得4个转基因植株。RT-PCR半定量和实时荧光定量RT-PCR分析表明，转基因烟草株系的叶片中有SBEⅡb基因的表达，与对照植株相比，转SBEⅡb基因的植株中的转录本达到了显著性的变化，但是其淀粉分支酶活性没有达到显著性变化。

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作者
王自布;
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作者单位

石河子大学;

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授予单位石河子大学;
学科作物遗传育种
授予学位博士
导师姓名齐军仓,李卫华;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类优良品质的育种;
关键词
小麦; 籽粒淀粉; 生物合成; 淀粉分支酶基因; 克隆技术; 分子特征;

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