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姜黄素诱导HO-1表达增强人脐静脉血内皮祖细胞活力及抗氧化损伤能力的实验研究

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前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要试剂配制

3 人脐静脉血内皮祖细胞体外分离和培养

4 实验分组

5 主要实验方法

实验结果

1 EPCs鉴定结果

2 CMN对EPCs的影响结果

3 CMN诱导EPCsHO-1表达的信号机制结果

4 CMN增强EPCs活力及抗氧化损伤结果

讨论

1 EPCs的体外分离、培养及鉴定

2 CMN诱导EPCs HO-1表达

3 CMN诱导EPCs HO-1表达的信号机制

4 氧化应激损伤与CMN的保护作用和CMN增强EPCs活力的研究

结语

结论

参考文献

缩略词表

致谢

HO-1在血管内皮细胞中的作用研究进展综述

1 HO-1与心血管内皮细胞

2 HO-1与肿瘤血管内皮细胞

3 HO-1与脑血管内皮细胞

4 HO-1与肺血管内皮细胞

5 HO-1与肾血管内皮细胞

6 HO-1与脐静脉内皮细胞

结语与展望

参考文献

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摘要

目的:体外分离、培养及鉴定人脐静脉血内皮祖细胞(EPCs)。探讨姜黄素(Curcumin, CMN)诱导EPCs表达血红素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)增强自身细胞活力及抗氧化损伤能力的作用及机制。
　　方法:实验研究分为四部分:1.人脐静脉血EPCs的分离、培养、鉴定:采用密度梯度离心法分离、培养人脐静脉血EPCs,通过倒置相差显微镜下观察EPCs形态学变化,免疫荧光法观察EPCs吸收Dil-ac-LDL和FITC-UAE-1情况并对7d的EPCs进行CD133免疫荧光鉴定。2.CMN的细胞毒性作用及诱导EPCs表达HO-1的效果评价:将培养的EPCs分为A、B、C、D四组,分别以终浓度为0、5、10、15μmol/L CMN的培养基孵育24h,CCK-8检测各组细胞增殖活力、比色法检测各组培养液中LDH活力,分析 CMN对EPCs是否具有细胞毒性作用。Western blot检测各组细胞HO-1表达量,明确CMN诱导EPCs表达HO-1的作用以及选择后续实验所需CMN的最佳浓度。3.CMN诱导EPCs表达HO-1的细胞内信号转导机制研究:将培养的EPCs分为A、B、C三组,分别在单纯培养基、终浓度15μmol/L CMN的培养基、终浓度15μmol/L CMN+1μmol/L全反式视磺酸(ATRA)的培养基中孵育24h。Western blot检测各组细胞HO-1表达量,探讨CMN诱导EPCs表达HO-1的信号机制。4.CMN诱导EPCs表达HO-1增强自身细胞活力及抗氧化损伤能力的作用及机制研究:将培养的EPCs分为A、B、C、D四组,分别在单纯培养基、终浓度15μmol/L CMN的培养基、终浓度500μmol/L H2O2+15μmol/L CMN的培养基、终浓度500μmol/L H2O2+15μmol/L CMN+10μmol/L锌原卟啉(ZnPPIX)的培养基中孵育24h。CCK-8检测各组细胞活力、比色法检测各组培养液中LDH活力、ELISA法检测各组培养液中的血管内皮生长因子(VEGF)和人碱性成纤维生长因子(bFGF)活力、AnnexinV-FTTC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。明确CMN增强EPCs活力及抗氧化损伤能力的作用及机制。
　　结果:1.从脐静脉分离出来的单核细胞培养3-4d开始贴壁;7d后有一定方向性,呈簇状生长;大约9d时出现多个血岛样细胞团。表面标记 CDl33免疫荧光检测显示绿色阳性率>90％,免疫荧光鉴定显示>90％的贴壁细胞呈双荧光染色阳性。2.以终浓度分别为0、5、10、15μmol/L的CMN孵育的各组EPCs,细胞增殖活力分别为(0.743±0.250)、(0.810±0.135)、(0.854±0.374)、(0.895±0.193),组间比较有显著差异(P<0.05),表明EPCs的增殖活力随CMN浓度的升高而明显升高;LDH活力分别为(732.4±45.2)、(728.1±35.8)、(745.7±48.6)、(750.2±47.3),组间比较无差异(P>0.05),表明CMN对EPCs无明显毒性作用;代表HO-1表达量的光密度比值分别为(0.65±0.02)、(0.87±0.08)、(1.25±0.05)、(1.34±0.03),组间比较显著差异(P<0.05),表明EPCs表达HO-1的量随CMN浓度的升高而升高。3.实验3中A、B、C三组测得的代表HO-1表达量的光密度比值分别为(0.47±0.04)、(1.43±0.02)、(1.11±0.05),B组明显高于与A组与C组(均为P<0.05)。4.实验4的A、B、C、D四组中,细胞增殖活力分别为(0.752±0.238)、(0.640±0.119)、(0.724±0.450)、(0.681±0.309);VEGF分别为(40.52±2.63)、(15.81±3.24)、(31.43±2.90)、(20.74±2.16);bFGF分别为(80.32±3.58)、(49.64±4.73)、(65.29±5.12)、(54.17±4.98),上述3项指标的组间比较显示,B,C、D组均明显低于A组(均为P<0.05),其中,B、D组又低于C组(均为P<0.05),而B、D两组间则无明显差异(P>0.05)。各组LDH活力分别为(511.2±58.6)、(830.4±54.3)、(725.8±49.4)、(795.6±58.7);细胞凋亡率分别为(1,95±0.83)、(25.07±2.54)、(17.03±2.04)、(22.55±1.98),上述2项指标的组间比较显示,B,C、D组均明显高于A组(均为P<0.05),其中,B、D组又高于C组(均为P<0.05),而B、D两组间则无明显差异(P>0.05)。
　　结论:浓度≤15μmol/L的CMN对人脐静脉血EPCs无明显毒性作用,并能呈剂量依赖性诱导EPCs高表达HO-1;CMN可能主要通过Nrf2/ARE信号途径诱导EPCs中HO-1的表达;CMN能显著增强EPCs增殖与分泌细胞因子的活力和抗氧化应激损伤能力,且这一作用很可能是通过诱导EPCs高表达HO-1实现的。

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