基于核酸扩增技术的药物和药物靶标检测新方法研究

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核酸扩增技术是一种高灵敏度的分子诊断技术，自1985年聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)创建以来，在聚合酶链式反应这一基本原理的基础上，新材料新技术的不断涌现，发展出一系列新的核酸扩增技术和检测方法，这些以核酸分子为识别元件或检测靶标的生物传感技术的不断发展，逐渐成为分子生物学、基因组学、疾病诊断学等领域的基本研究手段。为了满足临床和现场快速检测(point-of-care testing, POCT)的需求，开发出一类简单、快速、高灵敏度、高选择性的核酸扩增技术具有非常重要的实际意义。本论文构建了具有实际应用前景的核酸扩增检测新方法。主要研究内容包括以荧光定量PCR技术为基础，开发了基于helper qPCR体系的铂类药物和miRNA的检测新方法以及自组装的硫代DNA回文结构启动自身扩增反应的T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase，T4PNK)的定量检测新方法。整个论文分为以下三部分: 1.绪论绪论部分主要阐述了本论文的研究目的、意义、主要内容和研究技术路线。 2.基于helper qPCR技术的铂类药物和miRNA检测新方法传统的铂离子检测技术，主要采用光学检测，需要复杂的衍生化处理步骤且难以避免生物基质的干扰;LC-MS技术在铂类药物检测中应用最为广泛，但存在仪器设备要求高、样品检测前的分离富集步骤耗时费力等缺点。因此，我们将铂类药物交联DNA碱基的特性与PCR技术相结合，开发了一种简单快捷、灵敏度高、选择性好的铂类药物检测新技术，同时该体系还能用于以核酸分子miRNA为靶标的定量检测。该方法对铂离子的检测限达1 ng/mL,对miRNA的检测限可达1 pmol。 3.基于硫代自组装策略的T4PNK定量检测新方法在核酸扩增反应中，引发反应的方式多种多样，大多数的反应依赖于引物启动扩增，但在DNA扩增机制中，一种新型的扩增方法无需额外加入引物即可扩增，即单链核苷酸的3'-端发夹序列折叠形成的回文哑铃状结构可以自身序列为模板启动扩增。我们利用这一机制构建了一种基于DNA回文结构启动扩增反应的硫代自组装技术用于对去磷酸化酶T4PNK的定量检测，并对方法进行了机理研究和实验条件的筛选优化，提高了该方法的扩增效率和灵敏度，该方法对T4PNK的检测限达1 mU/mL。

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作者
杨丹;
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作者单位

浙江大学;

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授予单位浙江大学;
学科药学
授予学位硕士
导师姓名曾苏,蔡圣;
年度 2019
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类动物医学（兽医学）;诊断学;
关键词
核酸; 扩增技术; 药物; 靶标检测;

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