酿酒酵母中虾青素生物合成及其代谢调控的研究

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致谢

摘要

缩写词表

1 文献综述

1．1 虾青素的概述

1．1．1 虾青素的简介

1．1．2 虾青素的理化性质

1．1．3 虾青紊的生理功能与应用

1．2 虾青素的生产方法与现状

1．2．1 化学合成

1．2．2 生物提取

1．3 虾青素的生物合成途径

1．4 虾青素的异源合成研究进展

1．4．1 利用细菌异源合成虾青素的研究进展

1．4．2 利用酵母异源合成虾青素的研究进展

1．5 代谢改造酿酒酵母生产萜类化合物的研究

1．5．1 酿酒酵母生产的代表性萜类化合物

1．5．2 酿酒酵母中生产萜类化合物的代谢途径工程研究

1．6 合成生物学研究中常用的代谢调控策略

1．7 本课题研究的内容与意义

2 虾青素生物合成途径基因的克隆与表达

2．1 引言

2．2 实验设备与材料

2．2．1 仪器设备

2．2．2 试剂和引物

2．2．3 菌株和质粒

2．2．4 主要溶液及培养基配置

2．3 实验方法

2．3．1 雨生红球藻RNA的抽提与基因的反转录

2．3．2 分子克隆实验

2．3．3 酿酒酵母转化方法

2．3．4 酿酒酵母的整合基因型验证

2．3．5 pUMRI质粒的整合与选择标记的去除

2．3．6 酿酒酵母的摇瓶培养

2．3．7 定性和定量分析荧光强度

2．3．8 类胡萝卜素的抽提与检测分析

2．4 实验结果与讨论

2．4．2 crtZ和bkt基因的克隆

2．4．3 整合crtZ和bkt基因合成虾青素

2．4．4 crtZ和bkt的密码子优化

2．4．5 虾青素构型的测定

2．4．6 CrtZ和BKT的底物选择性分析

2．4．7 OcrtZ和Obkt基因拷贝数对虾青素产量的影响

2．5 本章小结

3 结合定向进化与代谢工程调控限速酶提高虾青素产量

3．1 前言

3．2 实验材料与试剂

3．3 实验方法

3．3．1 重组质粒的构建

3．3．2 OBKTM的定向进化流程

3．3．3 融合蛋白的构建

3．3．4 OBKTM和OCrtZ的共定向进化

3．3．5 重组菌株的构建流程

3．3．6 菌株的稳定性分析

3．3．7 菌株的培养和类胡萝卜素产物分析

3．3．8 角黄素标曲的测定

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 Fe2+辅因子对虾青素合成的影响

3．4．2 表达CrtE03M对前体物质β-胡萝卜素产量的影响

3．4．3 OBKT的定向进化

3．4．4 CrtE03M和OBKTM对虾青素产量的影响

3．4．5 YastD-03双倍体菌株产虾青素的稳定性分析

3．4．6 OCrtZ和OBKTM融合表达

3．4．7 OCrtZ和OBKTM共定向进化

3．5 本章小结

4 酿酒酵母温度响应蛋白开关的设计与构建

4．1 前言

4．2 实验材料与试剂

4．2．1 试剂和引物

4．2．2 菌株

4．3 实验方法

4．3．1 基因的扩增与质粒的构建

4．3．2 GAL4基因的敲除

4．3．3 温敏型Gal4的定向进化

4．3．4 荧光显微镜和流式细胞仪分析EGFP的强度

4．3．5 实时荧光定量PCR

4．3．6 培养基中葡萄糖浓度的测定

4．3．7 乙醇标曲的制作与发酵液中乙醇含量的测定

4．3．8 番茄红素的抽提与分析

4．3．9 分批补料发酵

4．4 实验结果

4．4．1 温度响应的动态调控系统设计

4．4．2 温敏型Gal4定向进化商通量筛选方法的建立

4．4．3 温敏型Gal4突变体的筛选和鉴定

4．4．4 温度对温敏型Gal4调控系统的影响

4．4．5 Gal4温敏型调控系统的表征

4．4．6 温度调控系统在番茄红素合成中的应用

4．4．7 利用温度调控系统进行番茄红素的两阶段发酵生产

4．5 本章小结

5 温度响应型虾青素生物合成途径的构建

5．1 引言

5．2 材料和试剂

5．3 实验方法

5．3．1 表达载体的构建

5．3．2 菌株的构建

5．3．3 产虾青素菌株的摇瓶培养

5．4．1 温度调控的虾青素合成菌株的构建与表征

5．4．2 虾青素的高密度发酵生产

5．5 本章小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

作者简历及攻读博士学位期间的研究成果