问号钩端螺旋体vwa基因产物竞争性抑制vWF/GPIbα介导血小板聚集引发出血机制

声明

致谢

序言

摘要

英文缩写词表

第1章引言

1．1钩端螺旋体

1．2钩端螺旋体病

1．3人血管性假血友病因子

1．4研究内容及目的

1．4．1研究内容

1．4．2研究目的

1．5研究路线

1．6本论文创新之处

第2章问号钩端螺旋体vwa基因的克隆与表达

2．1材料

2．1．1实验菌株

2．1．2实验质粒

2．1．3实验动物

2．1．4主要仪器

2．1．5主要试剂

2．1．6主要试剂配制

2．2方法

2．2．1问号钩体vwa基因产物功能结构域的分析

2．2．2问号钩体vwa序列生物信患学分析

2．2．3问号钩体的培养

2．2．4问号钩体基因组DNA的提取

2．2．5目的基因的扩增及扩增产物的纯化

2．2．6 T-A克隆

2．2．7 vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因原核表达系统的构建及重组蛋白的提纯

2．2．8 rL-vWA-Ⅰ和rL-vWA-Ⅱ蛋白LPS的去除和测定

2．3结果

2．3．2问号钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因产物序列均无跨膜区

2．3．3问号钩体vwa-Ⅰ528或vwa-Ⅱ603基因产物序列均无信号肽

2．3．4问号钩体vwa-Ⅰ528或vwa-Ⅱ603基因产物结构与人vWF-A相似

2．3．5问号钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603基因的PCR扩增

2．3．6 T-A克隆鉴定

2．3．7亚克隆鉴定

2．3．8 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ的表达提纯

2．3．9 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ中无LPS污染

2．4小结

第3章钩体vwa基因产物与人血小板和GPIbα的结合能力

3．1材料

3．1．1主要仪器

3．1．2主要试剂

3．1．3主要试剂的配制

3．2方法

3．2．1 PCR检测钩体vwa基因在不同血清群血清型钩体中的分布

3．2．2 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vwA-Ⅱ圆二色谱(CD)分析

3．2．3血小板的制备

3．2．5 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vwA-Ⅱ抗体封闭试验

3．2．8 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与rHu-GPIbα约结合

3．2．9共沉淀试验

3．2．12银染

3．2．13统计学分析

3．3结果

3．3．1钩体vwa基因在不同血清群血清型钩体中的广泛分布

3．3．2 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ的园二色谱扫描结构

3．3．3 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与血小板的强结合能力

3．3．4 SPR检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与rHu-GPIbα的强结合能力

3．3．5 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ与rHu-GPIbα的强结合能力

3．3．7 rHu-GPIbα捕获钩体全蛋白中Lep-vWA-Ⅰ和Lep-vWA-Ⅱ的质谱鉴定

3．4小结

第4章钩体vwa基因产物抑制血小板聚集及信号通路的检测

4．1材料

4．1．1主要仪器

4．1．2主要试剂

4．1．3主要试剂的配制

4．2方法

4．2．1人外周血中血小板的分离

4．2．4 Western blot检测血小板信号通路激酶的表达及磷酸化水平

4．2．5血小板NO的定量测定

4．2．6血小板cGMP的定量测定

4．2．7血小板TXA2的定量测定

4．2．8血小板ADP的定量测定

4．2．9血小板Ca2+的定量测定

4．2．10统计学分析

4．3结果

4．3．2 rLep-vWA-IgGs阻断rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ抑制血小板聚集

4．3．3 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后激酶磷酸化修饰水平无变化

4．3．4 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后NO水平无升高

4．3．5 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后cGMP水平无升高

4．3．7 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWrA-Ⅱ作用血小板后ADP水平无升高

4．3．8 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用血小板后Ca2+水平无升高

4．3小结

第5章钩端螺旋体vwa基因产物突变体的功能

5．1材料

5．1．1实验菌株

5．1．2实验质粒

5．1．3主要仪器

5．1．4主要试剂

5．1．5主要试剂配制

5．2方法

5．2．8 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与rHu-GPIbα的结合

5．2．9统计学分析

5．3结果

5．3．3钩体vwa-Ⅰ528和vwa-Ⅱ603突变体蛋白无LPS污染

5．3．4 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白对抑制血小板聚集能力的减弱

5．3．5 rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与血小板结合能力的减弱

5．3．6 SPR检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与rHu-GPIbα结合能力的减弱

5．3．7 ITC检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ突变蛋白与rHu-GPIbα结合能力的减弱

5．4小结

第6章钩体感染HUVEC后vwa基因表达及其外分泌情况

6．1材料

6．1．1实验菌株

6．1．2实验细胞

6．1．3主要仪器

6．1．4主要试剂

6．1．5主要试剂配制

6．2．2钩体的计数

6．2．3 RT-PCR引物

6．2．4钩体感染HUVEC前后vwa基因mRNA表达水平变化

6．2．5问号钩体总RNA的提取

6．2．6 RNA的定量

6．2．7反转录反应

6．2．8实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

6．2．9钩体胞内总蛋白的提取

6．2．11钩体L-vWA-Ⅰ和L-vWA-Ⅱ分泌的抑制试验

6．2．12 Western blot

6．2．13 Western blot条带灰度值的分析

6．2．14统计学分析

6．3结果

6．3．2钩体感染HUVEC后胞内Lep-vWA-Ⅰ和Lep-vWA-Ⅱ表达水平的升高

6．3．3钩体感染HUVEC后Lep-vWA-Ⅰ和Lep-vWA-Ⅱ可以外分泌

6．3．4分泌系统抑制剂对L-vWA-Ⅰ和L-vWA-Ⅱ分泌的影响

6．4小结

第7章问号钩体vwa基因产物诱导动物体内出血

7．1材料

7．1．1实验动物

7．1．2主要仪器

7．1．3主要试剂

7．1．4主要试剂的配制

7．2方法

7．2．2 rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ诱导动物体内出血及出凝血参数的测定

7．2．3统计学分析

7．3结果

7．3．2 rLep-vWA-Ⅰ或rLeP-vWA-Ⅱ注射小鼠后外周血出凝血时间的延长

7．4小结

第8章讨论与总结

第9章人vWF的结构与功能(综述)

参考文献

附录

作者简历及在学期间所取得的科研成果