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微生物制剂和碳源对水产养殖环境的影响及作用机制

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第一章 研究综述

1．1 中国池塘养殖现状及存在问题

1．2 水产养殖环境中氨氮和亚硝酸盐的危害及其转化途径

1．2．1 氨氮和亚硝酸盐对水产动物危害

1．2．2．微生物在水环境中氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐的转化中的作用

1．3．水产养殖环境中的细菌多样性

1．3．1 水产养殖环境中细菌群落结构及影响因素

1．3．2 水产养殖活动对细菌群落影响

1．3．3 环境中细菌对水产养殖生物生长和免疫影响

1．4．微生物制剂在改善水产养殖环境方面的应用

1．4．1 益生菌的定义

1．4．2 构成微生物制剂的常见菌株

1．4．3 微生物制剂在改善水产养殖环境方面的作用

1．4．4 微生物制剂对水产养殖环境中微生物群落的影响

1．4．5 微生物制剂和营养素的联用

1．5．添加碳源在改善水产养殖环境方面的作用

1．5．1 生物絮团及其在水产养殖中的应用

1．5．2 添加碳源对降低水环境中氨氮的影响

1．5．3 添加碳源对水环境中反硝化作用的影响

1．5．4 添加碳源对细菌群落的影响

1．6 实验目的与意义

第二章 长三角地区鱼类混养和蚌鱼综合养殖池塘中的微生物多样性

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 养殖池塘和采样过程

2．2．2 16S rDNA的提取和测序

2．2．3 化学分析方法

2．2．4 统计分析

2．3 实验结果

2．3．1 细菌组成、丰度、多样性

2．3．2 非生物环境

2．3．3 细菌群落和环境之间的关系

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 添加商业微生物制剂和碳源对蚌鱼综合养殖产量和水质的影响

第—节 添加四种商业微生物制剂对蚌鱼综合养殖产量和水质的影响

3．1．1 引言

3．1．2 材料和方法

3．1．3 结果

3．1．4 讨论

3．1．5 小结

第二节 调节水体碳氮比对蚌鱼综合养殖中细菌群落和水化学的影响

3．2．1 引言

3．2．2 材料和方法

3．2．3 结果

3．2．4 讨论

3．2．5 小结

第三节 添加微生物制剂和碳源对鱼类混养系统中水质和细菌群落的影响

3．3．1 引言

3．3．2 实验材料和方法

3．3．3 结果

3．3．4 讨论

3．3．5 小结

第四章 微生物制剂和碳源影响养殖水质的机制

4．1．1 引言

4．1．2 实验材料和方法

4．1．3 结果

4．1．4 讨论

4．1．5 小结

第二节 添加外源细菌对小球藻(Chlorella variabilis)初级生产力和土著细菌的影响

4．2．1 引言

4．2．2 材料与方法

4．2．3 结果

4．2．4 讨论

4．2．5 小结

第三节 添加有机碳源对降低鱼类混养系统中氨氮的作用

4．3．1 引言

4．3．2 实验材料与方法

4．3．3 结果

4．3．4 讨论

4．3．5 小结

第四节 微生物制剂和外源碳在氨氮转化中的关系

4．4．1 引言

4．4．2 实验方法与材料

4．4．3 结果

4．4．4 讨论

4．4．5 小结

研究结论

创新点

研究展望

参考文献

致谢

个人简历

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摘要

通过微生物操纵改善养殖环境是近十多年来水产养殖研究的热点。目前水产养殖生产中采用的微生物调控手段包括添加外源微生物（微生物制剂）或外源营养（碳）。有关微生物制剂改善养殖水质的效果，特别是降解无机氮的方面的作用尚存在分歧，原因之一是对微生物制剂影响环境的作用途径缺乏了解。添加微生物制剂不仅增加外源微生物，同时增加了有机碳，其对水环境的影响究竟是通过外源微生物在环境中定植、生长和相应的功能表达，还是通过改变原有微生物群落和功能？回答这一问题有助于正确评价微生物制剂改善水产养殖环境的作用。本研究利用原位实验系统探讨了添加微生物制剂和碳源对鱼类混养系统和蚌鱼综合养殖系统中土著细菌、浮游植物群落以及水中无机氮转化的影响，并分析了微生物制剂和碳源对养殖环境的交互影响。主要研究结果如下:
　　1)采用16S rDNA测序分析了青鱼（Mylopharyngodon piceus）、加州鲈（Micropterus salmoides）、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）养殖池塘中的细菌多样性。从12个池塘水体和底泥中分别获得了3701和11150个OTU。底泥中的OTU数目、ACE指数、Chao1指数、香农多样性指数均高于水层，表明底泥细菌的多样性和稳定性高于水层;水体中细菌优势门为Proteobacteria、Actinobacteria、Baeteroidetes，包括26个优势属，底泥中细菌优势门为Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes、Acidobacteria、Nitrospirae，包括25个优势属。不同类型养殖池塘细菌组成在门水平上相似，在属水平上表现出较大的差异。池塘中细菌群落与水体硬度、氨氮、总氮显著相关。青鱼、加州鲈、黄颡鱼池塘中的氨氧化细菌(Nitrosomonadaceae_uncultured)相对丰度高于三角帆蚌池塘中，但池塘中氨氮浓度高于后者;青鱼、加州鲈、黄颡鱼池塘中的亚硝酸盐氧化细菌（Nitrospinaceae_uncultured）相对丰度高于三角帆蚌池塘中，但池塘中亚硝氮浓度高于后者。上述结果表明养殖种类和管理方式对养殖池塘细菌多样性具有显著的影响。
　　2)通过80天的池塘原位实验评价诺碧清生物氨硝净、碧沃丰生物BZT清污、华元谷纳豆芽孢杆菌、EM微生物环境改良剂四种商业微生物制剂对三角帆蚌，草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和鲫鱼（Carassius gibelio）综合养殖系统产量和水质的影响。添加微生物制剂后蚌产量下降，对鱼产量无显著影响，对水质无明显的改善作用，但影响水体中细菌和浮游植物群落。水中细菌主要以Actinobacteria,Chlorobi，Verrucomicrobia,Proteobacteria为主。总氮、总磷、CODMn、蓝藻生物量对细菌群落具有显著影响。上述结果表明微生物制剂对改善蚌鱼综合养殖的效果不明显。
　　3)通过30天室外水槽实验评价了碳氮比(6，8，10，12，14)对三角帆蚌、草鱼、鲫鱼和鲢（Hypophthalmichthys molitrix）综合养殖系统水质和细菌群落的影响。实验期间，每天投喂鲫鱼配合饲料。第0天、10天、20天、30天采样分析水质指标，第30天采集水体和底泥样品分析细菌群落。实验中总氮、总磷、总有机碳逐渐积累。氨氮和亚硝氮随着碳氮比升高而降低。水体和底泥中的细菌群落无论在门还是属的水平上均随着碳氮比升高而改变，导致水体和底泥中细菌群落明显变化的碳氮比分别是10和12。碳氮比升高有利于潜在益生菌和致病菌的生长。高碳氮比提高了水体和底泥细菌中化能异养和碳水化合物降解功能团的相对丰度，降低了硝化和反硝化功能团的相对丰度。上述结果表明添加外源碳改变水中碳氮比可显著影响蚌鱼综合养殖系统中的细菌群落和水质。
　　4)比较了添加碳源、添加微生物制剂、联合添加碳源和微生物制剂对鱼类混养系统环境和细菌群落的影响。实验利用设在养殖池塘中的2000L原位水槽进行，每个水槽中放养2尾草鱼、2尾鲫、1尾鲢。每天投喂配合饲料。当实验进行到40天时将水槽分为四组，一组作为空白对照，一组每6天添加葡萄糖60g，一组每6天添加诺碧清净水剂和氨硝净各2g，一组每6天添加葡萄糖60g、诺碧清净水剂和氨硝净各2g。实验结果表明:添加碳源能显著降低氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐，添加微生物制剂不能降低无机氮，添加碳源和微生物制剂对降低无机氮无协同作用。添加处理前后，各处理组中无论在门或属水平上的优势种均未发生变化。碳源和微生物制剂影响Bacillus和hgcI_clade属细菌的相对丰度且两者存在交互效应。
　　5)分析了蚌鱼综合养殖池塘中铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）和血红裸藻（Euglena sanguinea）水华中大型聚集物(直径＞10μm)结合细菌、小型聚集物（直径1-10μm）结合细菌、浮游细菌（直径0.22-1μm）。两种水华中优势细菌门为Proteobacteria和Bacteroidetes，而Actinobacteria门细菌的相对丰度在两种水华水体中都有所降低。Gemmatimonadetes门细菌主要集中在大型聚集物上，Bacteroidetes门细菌主要集中在小型聚集物上，Candidate_division_TM7门细菌主要聚集在浮游细菌群落中。蓝藻水华中细菌优势种为Chlorobi，Chloroflexi，Fusobacteria门细菌;裸藻水华中细菌优势种为Deinococcus-Thermus门细菌。化能异养功能团主要集中在小型聚集物上和浮游细菌中，而需氧氨氧化，硝化反应、人体疾病相关功能团主要集中在蓝藻水华中大型聚集物上。上述结果表明藻际环境提供了不同的细菌生态位，不同的细菌表现出功能分化。不同浮游植物种类水华中存在各自的特异性细菌群落。
　　6)在单种培养小球藻（Chlorella variabilis）中添加微生物制剂诺碧清（两株活性菌种为Bacillus licheniformis和Bacillus sp.），在有光照和无光照的情况下分别监测初级生产力和群落呼吸。结果表明添加外源细菌后显著提高小球藻初级生产力和群落呼吸，增加了小球藻丰度和藻液中细菌丰度，但对小球藻藻液中细菌群落未产生显著影响。该研究表明外源细菌可以通过提高小球藻初级生产力和细菌丰度改善水质，但未改变细菌群落组成。
　　7)分析了外源碳调控鱼类混养系统中无机氮途径及浮游植物和细菌对无机氮转化的作用。利用2000L聚乙烯水槽构建中型混养实验系统，每个水槽中放养1公斤草鱼，3条鲫，1条鲤鱼（Cyprinus carpio），1条鲢。每天投喂配合饲料。实验进行30天后，按照氨氮与外源碳1∶3和1∶6的比例设低碳源组和高碳源组，另设一组空白对照。实验结果表明，对照组、低碳源组、高碳源组中氨氮均显著下降，对照组中以硝化作用为主，低碳组中兼有硝化作用和同化作用，高碳组中以同化作用占主导。低碳组中细菌群落内差异程度显著低于对照组和高碳组的组内细菌群落差异。细菌Chloroflexi门及其门下的Roseiflexus属相对丰度随着碳源增加而增加。此外，利用500mL蓝盖玻璃瓶构建原位微型实验系统。一组不添加任何东西作为空白对照;一组按氨氮∶外源碳=1∶6添加碳源;一组先将浮游植物过滤后再添加碳源;一组添加碳源同时添加抗生素抑制细菌生长。实验结果表明，碳源丰富情况下细菌和浮游植物对氨氮存在竞争关系，细菌同化作用不但能利用氨氮还能利用亚硝酸盐和硝酸盐，浮游植物同化作用以氨氮为主，细菌同化作用很大程度上被浮游植物抑制。在碳源丰富的情况下细菌Proteobacteria门存在着竞争优势，而细菌Bacteroidetes和Spirochaetae门存在竞争劣势。碳源丰富情况下，Planctomycetes、Acidobacteria、Firmicutes门细菌的生长受浮游植物抑制。
　　根据本研究结果，得出如下结论:
　　1)在三角帆蚌，草鱼和鲫鱼综合养殖系统中添加诺碧清生物氨硝净、碧沃丰生物BZT清污、华元谷纳豆芽孢杆菌、EM微生物环境改良剂等四种商业微生物制剂不会明显改善养殖产量和水质。
　　2)在三角帆蚌、草鱼、鲫鱼和鲢综合养殖以及草鱼，鲫，鲤鱼和鲢混养系统中添加碳源可在一定程度上改善养殖水质，并且随着碳氮比变化养殖水体和底泥中细菌群落发生明显的变化。
　　3)将硝化菌剂灭菌后其功能与未灭菌的作用无明显变化，表明添加微生物制剂影响环境中无机氮转化的原因可能是其本身发挥了碳源的作用。

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