单核细胞增生李斯特菌：无菌斑马鱼感染模型及Mmp-9在抗细菌感染中的作用机制

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单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌）作为四大食源性病原菌之一，在环境中广泛存在，且对不良环境的耐受能力较强。人和动物食用了单增李斯特菌污染的食物后，细菌进入消化道并跨越宿主肠道屏障，随血液循环分布至全身脏器中，或穿过血脑屏障和胎盘屏障造成脑炎和流产等。单增李斯特菌拥有一套十分强大的毒力因子系统，感染过程中对宿主细胞的黏附和侵袭、细胞内增殖和细胞间扩散的每一步都由特定的毒力因子介导。内化素A(InlA)是该菌介导细菌黏附细胞的分子之一，能够与宿主细胞表面的E-钙黏蛋白共价结合，不同种宿主的E-钙黏蛋白识别位点不同，因此InlA的识别具有宿主特异性。经口感染单增李斯特菌在人源细胞上的黏附效率比在小鼠细胞上更高，是由于小鼠肠上皮细胞的E-钙黏蛋白与人的在第16位氨基酸上有差异，不能与InlA有效结合。而斑马鱼的E-钙黏蛋白在此位点上与人相同。
　　斑马鱼作为重要的模式脊椎动物之一，具有繁殖能力强、体外受精和发育、性成熟周期短，胚胎透明、易于遗传操作等诸多优点。斑马鱼具有与哺乳动物相似类型的免疫细胞，且先天免疫系统在胚胎时期独立于后天免疫而存在。以斑马鱼为模式动物建立病原微生物感染模型，对于病原的致病机制、宿主的先天免疫功能和病原与宿主之间互作关系的研究具有重要意义。然而普通斑马鱼饲养环境及其肠道内的微生物可能会影响特定病原感染的研究，因此以斑马鱼为模型进行感染与免疫研究需采用无菌斑马鱼。
　　本研究旨在:(1)建立无菌斑马鱼胚胎培养体系;(2)建立单增李斯特菌多种途径感染无菌斑马鱼胚胎的方法;(3)探明李斯特菌感染无菌斑马鱼胚胎转录组学特征;(4)探明基质金属蛋白酶9(Mmp-9)在介导巨噬细胞迁移和抗感染中的作用机制。
　　1.斑马鱼胚胎的无菌培养及评价
　　斑马鱼胚胎时期，后天免疫尚未发育（受精后4-6周），该时期是研究先天免疫功能的最佳时期。由于斑马鱼生活环境中微生物易大量繁殖，斑马鱼肠道中也有共生的微生物菌群，会激活斑马鱼先天免疫系统，从而影响试验结果。本研究成功建立了斑马鱼胚胎培育的无菌操作系统，无菌检验显示其生活环境及体内未检测到能形成菌落的病原微生物，先天免疫分子Toll样受体分子(Toll-likereceptors，TLRs)表达量较低或不表达，而常规培养斑马鱼以及浸泡感染单增李斯特菌的无菌斑马鱼中这些基因转录水平较高。我们认为该无菌系统培育的斑马鱼胚胎能够达到“相对无菌”，其先天免疫尚未激活，可应用于免疫系统功能、肠道固有菌群功能和特定病原感染机制等研究中。
　　2.单增李斯特菌不同感染途径对斑马鱼致病性的影响
　　卵黄注射单增李斯特菌强毒株EGDe能够引起斑马鱼迅速死亡，注射EGDe的斑马鱼卵孵化率为18％，相比弱毒株M7组80％、无害李斯特菌组88％和对照组90％的孵化率有显著下降。脑室注射单增李斯特菌能够引起斑马鱼胚胎逐渐死亡，并且能够观察到巨噬细胞迁移至脑内吞噬细菌，细菌能够在巨噬细胞中增殖。静脉注射100 CFU强毒株EGDe后就能导致鱼在一周内全部死亡，细菌能够在全身躯干血管、主静脉及眼周血管中分布并大量增殖，引起严重的感染。而弱毒株及无害李斯特菌则在感染后一定时间内被鱼体清除。以上三种注射感染途径中，李斯特菌属不同菌株的毒力与在小鼠模型中毒力相似:EGDe＞ M7＞无害李斯特菡。用高达1010 CFU/mL的EGDe浸泡感染斑马鱼虽不能引起死亡，但冰冻切片显示48 hpi(hours post infection)时细菌大量存在于鱼肠腔中未能突破肠道屏障，且在72 hpi被全部清除。强毒株感染组先天免疫基因cyp1a、irgll、il1b和mmp9的转录水平显著高于弱毒株感染组、无害李斯特菌感染组和未感染组。这些基因表达在48 hpi达到顶峰，在72 hpi回落至正常水平，提示可能是这些基因参与了细菌清除。
　　3.致病性与非致病性李斯特菌浸泡感染斑马鱼幼鱼的比较转录组学
　　应用Affymetrix基因芯片对斑马鱼14900个基因转录本进行杂交检测，发现单增李斯特菌感染的斑马鱼相对于空白对照组有239个基因表达上调(fold≥2.0)，56个基因表达下调(fold≤0.5)。无害李斯特菌感染的斑马鱼相对于空白对照组仅有25个基因上调，4个下调。而单增李斯特菌感染的斑马鱼相对于无害李斯特菌感染的鱼有102个基因上调。其中Mmp-9上调倍数最多，达20倍以上。荧光定量检测大部分基因表达趋势与基因芯片结果一致。对单增李斯特菌感染组相对空白对照组上调的239个基因和相对于无害李斯特菌感染组上调的102个基因分别进行Gene Ontology(GO)分析，发现这些上调的基因大多富集于GO:0005576和GO:0050896，分别与细胞外基质稳态平衡和抵御应激相关。将这些基因进行Gene Cluster分析，发现在紧密连接、信号转导、干扰素、热休克蛋白、纤连蛋白、补体和肌动蛋白等分类下的基因均有不同程度的上调。这些结果提示斑马鱼可能通过改变细胞外基质的稳态来抵御单增李斯特菌感染，这一过程中Mmp-9可能发挥了重要作用。
　　4.Mmp-9在斑马鱼抗感染过程中的作用机制
　　Mmp-9属于基质金属蛋白酶家族，是一种锌离子依赖的胶原蛋白酶，作用底物广泛，能在各种细胞中表达并参与组织修复、细胞运动、炎症发生等多项生理及病理过程，近来也有报道Mmp-9在抗感染过程中也发挥一定作用。早期的研究均认为Mmp-9水解细胞外基质，有助于巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞在细胞外基质中迁移。最近有研究发现，Mmp-9可能参与细胞内信号转导，激活细胞运动相关的通路，从而引起细胞迁移运动。我们利用特异Morpholino注射单细胞阶段的鱼卵，抑制Mmp-9表达，并对Mmp-9抑制后的鱼进行脑室注射、静脉注射及浸泡感染。结果显示，静脉注射感染Mmp-9抑制的鱼在24 hpi细菌载量显著高于正常鱼，在感染后2-3天内全部死亡，比正常鱼感染后死亡快。脑室注射感染后，Mmp-9抑制的鱼中迁移至脑内的巨噬细胞数显著低于正常鱼。浸泡感染虽仍不引起斑马鱼死亡，但Mmp-9抑制的鱼出现消化道出血现象。
　　本研究还利用RNA干扰技术，结合小分子化学药物作用，在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞模型上，对Mmp-9可能诱导的通路分子进行了探索。细菌感染及LPS刺激能够引起Mmp-9表达提高，同时也导致RAW264.7在Transwell上的迁移能力增强。沉默Mmp-9或Mmp-9在细胞内可能的受体分子CD44均能导致细胞体外迁移能力减弱，但Mmp-9的沉默不影响细胞吞噬细菌的能力和形成伪足的能力，也不影响细菌ActA作用引起的actin tail形成。抑制细胞RhoA通路上游分子FAK，中游分子ROCK均能在一定程度上减少由Mmp-9上调引起的细胞迁移，用细胞松弛素抑制肌动蛋白聚集后，由Mmp-9上调增多的细胞迁移活动完全被抑制。以上结果提示Mmp-9在抗感染过程中能够介导巨噬细胞迁移至感染部位，从而达到清除细菌的作用。Mmp-9通过非水解酶作用，与CD44或其他细胞表面受体结合，诱导细胞运动相关RhoA通路，从而引发细胞迁移运动。
　　综上所述，本研究建立了简易的无菌斑马鱼胚胎培养体系，用此无菌系统培育的斑马鱼胚胎先天免疫尚未激活，可用于其先天免疫系统对感染应答研究。用单增李斯特菌作为模式病原建立了多途径感染无菌斑马鱼的模型，可以用于比较不同种细菌或菌株致病力;浸泡感染单增李斯特菌能够引起无菌斑马鱼一系列先天免疫相关基因上调，其中上调倍数最多的是Mmp-9。该蛋白能增强巨噬细胞迁移能力，将其募集至感染部位发挥抗细菌感染的作用，这一功能与其基质蛋白水解酶活性无关。

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作者
单颖;
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作者单位

浙江大学;

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授予单位浙江大学;
学科预防兽医学
授予学位博士
导师姓名方维焕;
年度 2016
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正文语种中文
中图分类 R517.703;
关键词
单核细胞增生李斯特菌感染; 先天免疫系统; 基质金属蛋白酶9; 巨噬细胞迁移; 抗感染作用;

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