母系遗传2型糖尿病相关的线粒体tRNA突变及其功能研究

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2型糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，常伴有碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱。长期存在的高血糖会导致眼、肾、心脏、血管、神经等组织和器官的慢性损害以及功能障碍。糖尿病是由遗传和环境等因素共同作用引起的，研究发现，部分糖尿病具有母系遗传特征，提示线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)突变可能是糖尿病病的遗传基础之一。本研究对2型糖尿病人群进行遗传筛查，发现了两个具有母系遗传特性的汉族糖尿病家系。对两个家系的母系成员线粒体基因组进行测序发现，其中一个家系母系成员存在共同的甘氨酸转移核糖核酸(glycine transfer RNA，tRNAGly) T10003C突变，属于M11b单倍体型;另外一个家系的母系成员存在共同的谷氨酸转移核糖核酸(glutamic acidtransfer RNA，tRNAGlu) A14692G突变，属于B5单体型。
　　原核生物体内的转移核糖核酸（transfer RNA，tRNA），以及绝大部分真核生物细胞质中的tRNA都具有经典的二级结构，即三叶草结构。此外，tRNA分子还可以通过茎环之间的扭转使不同结构域的碱基之间形成氢键，进而维持tRNA分子稳定的倒L形三级结构。与上述两种tRNA不同，人线粒体tRNA二级结构中的A∶U配对和非Watson-Crick配对的数目偏多，同时具有缩短甚至缺失的茎环部分，这也导致了线粒体tRNA的低稳定性。此外，线粒体内的高氧化环境，使得线粒体tRNA的碱基非常容易受到突变的影响。
　　10003位于tRNAGly D臂保守的13位，U到C的转换与22位的G形成了13C-22G的新碱基配对。Northern Blot实验发现携带该突变的母系成员线粒体tRNAGly水平相较于对照细胞平均下降了约70％。tRNAGly稳态水平的降低导致患者细胞线粒体蛋白质合成水平较对照细胞下降了32.5％。线粒体蛋白质合成障碍进一步导致了线粒体氧化呼吸链复合体损伤，并影响细胞呼吸效率。经测定，患者细胞的线粒体基础氧气消耗速率(Oxygen consumption rate，OCR)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)偶联OCR、质子漏OCR、最大OCR、缓冲OCR和非线粒体OCR分别是对照细胞的53％、45％、84％、40％、39％和32％。线粒体呼吸异常会导致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平增加及氧化磷酸化和ATP合成的解偶联，减少ATP的合成，导致细胞能量代谢失衡，从而影响糖尿病的发生发展。
　　14692位于tRNAGlu TΨC环的55位(U55)，体内该位点被修饰成假尿嘧啶（Ψ55），与18位的A形成18A-55Ψ配对，与U19-G56一起维持tRNAGlu高级结构的稳定性。而A14692G突变则在55位引入了胞嘧啶(C)，破坏了原有的修饰与氢键配对。因此，该突变导致tRNA的结构稳定性下降，D环和T环之间的相互作用被打断，因此将D环和T环暴露出来，更容易被血管生成素识别并切割。在非变性电泳中，突变体的迁移率小于野生型;同时热变性实验结果表明，tRNAGlu A14692G突变体的Tm值(46℃)低于野生型tRNA(50℃)，这些数据均表明突变体tRNA具有更加疏松的构象和较低的结构稳定性。此外，携带该突变的细胞的tRNAGlu稳态水平较对照细胞下降了64.5％。线粒体DNA编码的多肽合成在携带突变的细胞中有不同程度的下降，从20％到66％不等，平均下降了29％。突变细胞的基础OCR、ATP偶联OCR、质子漏OCR、最大OCR、缓冲OCR和非线粒体OCR分别是对照细胞的59.5％、61％、56％、64％、67％和71.5.％。同时线粒体复合物活力检测也表明，复合物Ⅰ和复合物Ⅳ受到不同程度的影响，与对照细胞株相比，突变细胞复合物Ⅰ的活力只有野生型的52％，复合物Ⅳ为75％。突变体细胞中线粒体产生的ATP降低了39％。同时，线粒体膜电位下降了35％，ROS产生增加了33％。由tRNAGluA14692G突变引起的tRNAGlu结构不稳定及代谢紊乱，进而影响了线粒体的各项功能，最终导致细胞功能障碍。
　　因此我们的研究表明，携带tRNAGly T10003C及tRNAGlu A14692G突变的个体具有发展为糖尿病的高风险性。但在两个家系中母系成员的发病年龄不同及不完全的外显率，说明这两个突变所引起的tRNA结构和线粒体功能异常不足以引起强烈的临床症状，还可能存在其他的因素的调节作用，比如核修饰基因、表观遗传和环境因子的作用等，尤其是参与tRNA代谢的核修饰基因可能会调控携带tRNA突变的个体的表型显现。

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作者
刘浩;
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作者单位

浙江大学;

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授予单位浙江大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位博士
导师姓名管敏鑫;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R587.102.325;
关键词
2型糖尿病; 遗传分析; 线粒体; 转移核糖核酸; 突变分析; 细胞功能障碍;

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