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中华鳖免疫相关基因MAVS及TRIM14的特征、亚细胞定位及表达分析

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摘要

缩略词表

第一章 绪论

1.1 中华鳖概述

1.1.1 中华鳖生物学特性

1.1.2 中华鳖养殖概况及存在的问题

1.1.3 中华鳖病毒性疾病的研究进展

1.2 中华鳖天然免疫学研究进展

1.2.1 免疫组织与器官

1.2.2 获得性免疫

1.2.3 非特异性免疫

1.3 线粒体与抗病毒天然免疫

1.4 MAVS的研究进展

1.4.1 MAVS的发现

1.4.2 MAVS的结构

1.4.3 MAVS的作用机制

1.5 TRIM蛋白家族在抗病毒天然免疫中的作用

1.5.1 TRIM蛋白家族的结构、功能

1.5.2 TRIM蛋白家族的抗病毒功能

1.5.3 TRIM14蛋白与抗病毒天然免疫反应

1.6 研究目的及意义

第二章 中华鳖MAVS基因的克隆及其对外源Poly(I∶C)的免疫应答

2.1 材料与仪器

2.1.1 实验试剂

2.1.2 主要试剂配制

2.1.3 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 实验动物

2.2.2 MAVS序列分析

2.2.3 MAVS组织及胚胎表达分析

2.2.4 Poly(I∶C)对中华鳖MAVS基因表达的影响

2.2.5 MAVS蛋白的原核表达

2.2.6 Western blot检测

2.2.7 免疫组化分析

2.2.8 胶体金免疫电镜检测

2.2.9 数据统计分析

2.3 结果

2.3.1 MAVS序列和同源性分析

2.3.2 多序列比对和系统发育树的构建

2.3.3 MAVS在不同组织中的表达

2.3.4 MAVS在中华鳖不同胚胎发育时期的表达

2.3.5 Poly(I∶C)对中华鳖MAVS基因表达的影响

2.3.6 MAVS蛋白原核体外表达

2.3.7 Poly(I∶C)对MAVS蛋白表达的影响

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 中华鳖TRIMl4基因的克隆及其对外源Poly(I∶C)的免疫应答

3.1 材料与仪器

3.1.1 实验试剂

3.1.2 主要试剂配制

3.1.3 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 实验动物

3.2.2 TRIM14序列分析

3.2.3 TRIM14组织及胚胎表达分析

3.2.4 Poly(I∶C)对中华鳘TRIM14基因表达的影响

3.2.5 Western blot检测

3.2.6 免疫组化分析

3.2.7 胶体金免疫电镜检测

3.2.8 数据统计分析

3.3 结果

3.3.1 TRIM14序列和同源性分析

3.3.2 多序列比对和系统发育树的构建

3.3.3 TRIM14在不同组织中的表达

3.3.4 TRIM14在中华鳖不同胚胎发育时期的表达

3.3.5 Poly(I∶C)对中华鳘TRIM14基因表达的影响

3.3.6 Poly(I∶C)对TRIM14蛋白表达的影响

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 研究结果与展望

4.1 研究结果

4.2 主要创新点

4.3 不足与展望

参考文献

作者简历

致谢

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摘要

中华鳖(Pelodiscus sinensis)是我国重要的淡水养殖品种,具有较高的经济及药用价值。近年来,随着养殖规模的不断扩大、环境污染的加剧、品种的退化,由疱疹病毒、虹彩病毒、中华鳖病毒等病原微生物引起的传染性疾病日趋严重,对中华鳖养殖业造成了巨大的经济损失。中华鳖抗病毒天然免疫机制的研究目前还处在初步阶段,通过研究其免疫机制,不仅为中华鳖病毒性疾病防治提供了重要的理论基础,而且在爬行动物免疫学方面具有重要的指导意义。本实验中,我们研究了中华鳖线粒体抗病毒信号蛋白(Mitochondrialantiviral signaling protein, MAVS)及TRIM14(Tripartite motif-containing protein14)基因在中华鳖组织、不同胚胎发育时期及外源刺激后的表达情况,并通过Western blotting和免疫组织化学技术研究其在中华鳖小肠组织中的定位及表达情况,探讨了MAVS和TRIM14基因之间的关系及其在中华鳖抗病毒天然免疫中的作用。结果如下:
  1、经过对中华鳖MAVS基因的结构及同源性分析,发现该基因编码框为2673 bp,编码890个氨基酸,无信号肽序列,蛋白的分子量和等电点分别为94.6 Kda和5.99,具有典型的半胱天冬酶招募结构域(Caspase recruitment domain)和跨膜结构域(Transmembrane,TM)。RT-PCR和荧光定量实时PCR检测结果显示MAVS基因在鳖的心脏、脾脏、肾脏、肝脏、食道、胃、小肠、大肠和肌肉中均有表达,其中在心脏、脾脏和肌肉中的表达量较高;MAVS基因在中华鳖胚胎中的表达量随胚胎发育的不断完善而逐步提高;在受到外源Poly(I∶C)刺激后,小肠、肝脏、脾脏、肌肉组织内MAVS mRNA的表达量显著上调。Westernblotting和免疫组化检测结果显示MAVS蛋白在小肠中主要分布于肠道黏膜层,在肠上皮细胞、固有层中都有阳性细胞,主要在细胞质中表达;经Poly(I∶C)刺激后,小肠组织内的MAVS蛋白表达量显著上升,主要定位在线粒体外膜,也有部分游离在细胞质中。
  2、经过对中华鳖TRIM14基因的结构及同源性分析,发现该基因编码框为1116 bp,编码371个氨基酸,无信号肽序列,蛋白的分子量和等电点分别为43.2 Kda和8.01,具有典型的B30.2(PRY/SPRY)结构域。RT-PCR和荧光定量实时PCR检测结果显示TRIM14基因在鳖的心脏、脾脏、肾脏、肝脏、食道、胃、小肠、大肠和肌肉中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高;TRIM14基因在中华鳖胚胎中的表达量随胚胎发育的不断完善而逐步提高;在受到外源Poly(I∶C)刺激后,小肠、肝脏、脾脏组织内TRIM14 mRNA的表达量显著上调。Western blotting和免疫组化检测结果显示TRIM14蛋白在小肠中主要分布于肠道黏膜层,在肠上皮细胞、固有层中都有阳性细胞,主要在细胞质中表达;经Poly(I∶C)刺激后,小肠组织内的TRIM14蛋白表达量显著上升。免疫胶体金结果显示TRIM14蛋白位于线粒体外膜。

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