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宫内营养不良及早期GH干预对大鼠AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的影响及机制

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致谢

摘要

缩略语

引言

第一部分 宫内营养不良对大鼠脂代谢AMPK-α1／SREBP-1c／ACC-1通路的影响及机制

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

1．5 结论

第二部分 早期GH干预对SGA大鼠脂代谢AMPK-α1／SREBP-1c／ACC-1通路的影响及机制

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 结论

全文总结

展望

参考文献

综述 Role of microRNAs in metabolic syndrome

作者简历及在学期间所取得的科研成果

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摘要

背景:
　　脂代谢紊乱是成人代谢综合征发病的关键环节。流行病学研究发现，小于胎龄儿(SGA)与此密切相关。因此，寻找SGA患儿脂代谢异常的相关靶标，开展深入研究十分必要。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是一种在真核细胞生物中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是一个异源三聚体复合物，由α，β和γ三个亚基组成，α亚基又分为α1和α2催化亚基，其在肝脏脂质稳态调节中发挥重要作用。目前已经证实AMPK-α1的异常表达参与脂代谢紊乱的发生。但SGA个体整个发育期肝脏组织AMPK-α1表达水平的动态变化规律以及其调控的脂肪酸代谢是否参与SGA大鼠成年期脂代谢紊乱的发生？尚未见报道。我们将从AMPK-α1及其调控的脂肪酸代谢关键靶基因固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶-1（ACC-1）探讨SGA大鼠成年期出现脂代谢紊乱的可能机制。此外，表观遗传修饰对SGA诱导的各类代谢疾病的发生起了重要作用，但目前很少有人关注AMPK-α1基因的表观遗传修饰与SGA大鼠肝脏脂代谢的相关研究。近年来microRNAs（miRNAs）在脂质代谢中的作用受到密切关注，研究报道miR-370通过miR-122间接影响AMPK、SREBP-1c和ACC-1的表达，从而调控脂类代谢，但在SGA模型中这两个miRNA是否也参与对AMPK-α1、SREBP-1c及ACC-1基因的调控，有待进一步探讨。
　　目前，AMPK已经成为肝脏脂质代谢紊乱治疗的重要靶点之一。众多研究已表明，SGA者早期应用生长激素(GH)后的追赶生长可能对各项代谢参数均有益。外源性GH治疗能恢复肝脏AMPK-α总蛋白及磷酸化水平，发挥调脂功能。在SGA群体中，GH能否同样通过激活AMPK-α1影响其下游脂肪酸代谢相关基因从而达到早期预防成年期脂代谢紊乱发生？这将为今后指导临床SGA患儿GH治疗提供理论依据。
　　第一部分、宫内营养不良对大鼠脂代谢AMPK-α1/SREBP-1α/ACC-1通路的影响及机制
　　目的:
　　动态观察SGA大鼠从出生至成年期肝脏AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路、通路相关miRNA及组蛋白乙酰化修饰的变化，明确SGA大鼠脂代谢紊乱的分子机制。
　　方法:
　　采用孕鼠全孕程半饥饿法建立SGA大鼠模型。仔鼠在1天、21天和70天龄时分别测量体重和身长，留取血清及肝脏组织标本。采用酶法检测血清甘油三酯(TG)水平和肝脏TG含量;Western blot测定肝脏组织AMPK-α1和细胞核内成熟的SREBP-1c(nSREBP-1c)蛋白的表达水平;real-time RT-PCR测定肝脏组织AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表达水平;CHIP-PCR用于分析肝脏组织AMPK-α1基因组蛋白乙酰化水平;采用miRNA芯片技术和生物信息学方法对1天龄AGA及SGA大鼠肝脏组织差异miRNAs进行分析筛选，并对筛选结果采用real-time RT-PCR进行验证。
　　结果:
　　1.体重和身长比较:1天龄时SGA大鼠体重和身长均显著低于AGA大鼠(P均＜0.01);生后早期SGA大鼠出现生长追赶，以体重追赶为主，21天龄时体重与身长均未完全追赶上AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01）;至70天龄时体重与身长仍显著低于AGA大鼠(P＜0.05)。
　　2.血清TG水平比较:1天和21天龄时SGA和AGA大鼠间血清TG水平均无统计学差异，70天龄时SGA大鼠血清TG水平明显高于AGA大鼠（P＜0.05）。
　　3.肝脏TG含量比较:1天和21天龄时SGA和AGA大鼠间肝脏TG含量均无统计学差异，70天龄时SGA大鼠肝脏TG含量显著高于AGA大鼠（P＜0.05）。
　　4.各基因蛋白水平表达比较:1天龄时SGA和AGA大鼠间肝脏组织AMPK-α1和nSREBP-1c蛋白表达均无统计学差异;21天和70天龄时SGA大鼠肝脏组织AMPK-α1蛋白的表达均显著低于AGA大鼠（P均＜0.05），nSREBP-1c蛋白的表达均显著高于AGA大鼠（P均＜0.05）。
　　5.各基因mRNA水平表达比较:1天龄时SGA和AGA大鼠间肝脏组织AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表达均无统计学差异;21天和70天龄时SGA大鼠肝脏组织AMPK-α1 mRNA的表达均显著低于AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01），SREBP-1c mRNA的表达均显著高于AGA大鼠（P均＜0.01），ACC-1mRNA的表达均显著高于AGA大鼠（P＜0.05和P＜0.01）。
　　6.AMPK-α1基因组蛋白H3乙酰化水平比较:大鼠肝脏组织AMPK-α1基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平比较，1天龄时SGA与AGA大鼠间无统计学差异，21天和70天龄时SGA大鼠显著低于AGA大鼠（P均＜0.01）。
　　7.miRNA差异表达谱分析:分析1天龄时AGA和SGA大鼠肝脏组织miRNAs的表达谱，在SGA组中表达上调＞1.3的miRNA有8个，表达下调＜0.75的miRNA有22个。
　　8.miRNA-370和miRNA-122表达比较:1天龄时肝脏组织miR-122的表达，SGA与AGA大鼠间比较无统计学差异;miR-370的表达，SGA大鼠显著低于AGA大鼠（P＜0.05），与芯片筛查结果一致。21天和70天龄时肝脏组织miR-122的表达，SGA与AGA大鼠间比较均无统计学差异;这两个时间点miR-370的表达均无法检测到。
　　结论:
　　1.母鼠孕期营养不良所致的子代生长迟缓可延续至生后早期甚至成年期。
　　2.SGA大鼠幼年期和成年期肝脏脂代谢通路AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1发生改变，这一变化可能与成年期脂代谢紊乱的发生密切相关。
　　3.SGA大鼠幼年期和成年期肝脏AMPK-α1基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平明显降低。
　　4.SGA大鼠出生时miR-370的表达明显下降，该miRNA可能参与SGA大鼠胚胎期及新生儿期代谢的调控。
　　第二部分、早期GH干预对SGA大鼠脂代谢AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的影响及机制
　　目的:
　　探究GH干预能否通过影响组蛋白乙酰化修饰，调节肝脏AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的表达，改善SGA大鼠脂代谢紊乱。
　　方法:
　　采用前期建立的SGA大鼠模型，从大鼠21天龄断奶时进行rhGH(5 mg/kg/day)干预至35天龄，对照组予等量生理盐水每日同时腹腔注射，分组情况如下:SGA+rhGH组、SGA+NS组、AGA+rhGH组、AGA+NS组。测量大鼠体重和身长，留取血清及肝脏组织标本。采用酶联免疫吸附法检测血清胰岛素样生长因子1（IGF-1）水平;采用酶法检测血清TG水平和肝脏TG含量;Western blot测定肝脏组织AMPK-α1和nSREBP-1c蛋白的表达水平;Real-time RT-PCR测定肝脏组织AMPK-α1、SREBP-1c和ACC-1 mRNA的表达水平;CHIP-PCR用于分析肝脏组织AMPK-α1基因组蛋白乙酰化水平;对肝脏组织miRNA-122采用real-timeRT-PCR检测。
　　结果:
　　1.体重和身长比较:干预后，21至70天龄期间SGA+rhGH体重与身长增长倍数均略高于AGA+NS组、AGA+rhGH组及SGA+NS组，但差异无统计学意义。成年期（70天龄）大鼠体重与身长，SGA+NS组显著低于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P＜0.01和P＜0.05）;SGA+NGH、AGA+NS组和AGA+rhGH三组间均无统计学差异。
　　2.血清IGF-1水平比较:为探究rhGH腹腔注射是否有效应，测定了干预开始前21天龄，干预结束时35天龄及干预后成年期70天龄时大鼠血清IGF-1水平。干预开始前21天龄，血清IGF-1水平，SGA组明显低于AGA组(P＜0.05)。干预结束时35天龄，血清IGF-1水平，SGA+NS组显著低于SGA+rhGH组（P＜0.05），AGA+NS组略低于AGA+rhGH组，但差异不具统计学意义（P＞0.05）。干预结束后成年期70天龄，血清IGF-1水平，各组间无统计学差异（P均＞0.05）。
　　3.血清TG水平比较:干预后，成年期（70天龄）大鼠血清TG水平，SGA+NS组显著高于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三组间均无统计学差异。
　　4.肝脏TG含量比较:干预后，成年期（70天龄）大鼠肝脏TG含量，SGA+NS组显著高于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三组间均无统计学差异。
　　5.各基因蛋白水平表达比较:干预后，成年期（70天龄）大鼠肝脏组织AMPK-α1蛋白水平的表达，SGA+NS组显著低于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三组间均无统计学差异。大鼠肝脏组织nSREBP-1c蛋白水平的表达，SGA+NS组显著高于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P均＜0.05），SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三组间均无统计学差异。
　　6.各基因mRNA水平表达比较:干预后，成年期（70天龄）大鼠肝脏组织AMPK-α1 mRNA水平的表达，SGA+NS组显著低于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三组间均无统计学差异。大鼠肝脏组织SREBP-1c和ACC-1 mRNA水平的表达，SGA+NS组均显著高于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P均＜0.05）;SGA+rhGH、AGA+NS和AGA+rhGH三组间均无统计学差异。
　　7.AMPK-α1基因组蛋白H3乙酰化水平的表达比较:干预后，成年期(70天龄)大鼠肝脏组织AMPK-α1基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平，SGA+NS组均显著低于AGA+NS组及SGA+rhGH组（P均＜0.05）;SGA+rhGH组略低于AGA+NS组及AGA+rhGH组，但差异均无统计学意义;AGA+NS组与AGA+rhGH组无统计学差异。
　　8.miRNA-122的表达比较:干预后，成年期（70天龄）各组间大鼠肝脏组织miR-122的表达均无统计学差异。
　　结论:
　　1.生后早期对SGA大鼠进行GH干预，能有效促进其生长追赶。
　　2.生后早期GH的干预可改善SGA大鼠成年期脂代谢紊乱现象，可能与干预后大鼠肝脏AMPK-α1/SREBP-1c/ACC-1通路的表达改变密切相关。
　　3.GH可影响组蛋白乙酰化修饰。

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